Полуавтомат аврора про 200: Инверторный сварочный полуавтомат Aurora PRO OVERMAN 200 Mosfet 13709

Содержание

Инверторный полуавтомат OVERMAN 200 Mosfet AURORA PRO 13709

Особенности:

  • регулировка сварочного тока
  • регулировка сварочного напряжения
  • регулировка индуктивности для настройки желаемой жесткости дуги, глубины провара и формы валика
  • уверенная сварка алюминия
  • розетка 36В для подключения подогрева редуктора
  • настройка скорости протяжки проволоки: быстрая / медленная
  • высокая стабильность горения дуги, снижение образования брызг
  • работа при пониженном напряжении питающей сети — до 140В вольт
  • усовершенствованная технология инвертора MOSFET на базе транзисторов FUJI

Применение:

  • авторемонт
  • строительство
  • небольшое производство
  • монтаж металлоконструкций

Комплектация:

  • в комплекте с аппаратом идёт горелка MIG 15 3 метра — 1 шт. 
  • кабель 16mm2, 3 метра — 1 шт.
  • зажим на массу 300А — 1 шт.
  • газовый шланг (с комплектом хомутов) 3м (9мм) — 1шт. 
  • ролик с V-образной канавкой 0.8-1.0мм

Габариты и вес источника брутто: 560*360*530мм, 19.4кг

Данный аппарат может быть установлен на тележку AuroraPRO

Аппарат может быть дооснащён роликами подачи

Ролик сталь 0.6-0.8мм /SPEEDWAY 200-250-300 OVERMAN 160-180-200-250-250/3
Ролик сталь 0.8-1.0мм /SPEEDWAY 200-250-300 OVERMAN 160-180-200-250-250/3
Ролик сталь 1.0-1.2мм /SPEEDWAY 200-250-300 OVERMAN 160-180-200-250-250/3
Ролик AL 0.8-1.0мм /SPEEDWAY 200-250-300 OVERMAN 160-180-200-250-250/3

Гарантия — 2 года!

 

 

 

  Сварочный инвертор AuroraPRO OVERMAN 200 предназначен для полуавтоматической сварки в среде защитного газа MIG-MAG, а так же для работы с порошковой самозащитной проволокой в режиме NO GAS. . Благодаря продолжительному режиму работы на максимальных токах аппарат прекрасно подходит для работы как на бытовом так и на профессиональном уровне. В гараже, в автосервисе, на производстве — везде ОВЕРМАН 200, будет проявлять себя прекрасным и надежным помощником в деле. Overman 200 показал неплохие результаты при работе с алюминием. Мы рекомендуем этот аппарат для бытовой и полупрофессиональной сварки данного металла. Нагляное управление всеми важными параметрами сварки на лицевой панели позволит настроить полуавтомат для выполнения широкого спектра сварочных работ. Отдельным плюсом аппарата является возможность сварки в сетях с большими просадками питающего напряжения —  OVERMAN 200 способен работать при падении напряжения до 140 вольт. 

Технические характеристики:

Напряжение питающей сети 220  
Потребляемая мощность 5.6  
Рекомендуемая мощность генератора 7.7  
Потребляемый ток 35  
cos φ 0.73  
Напряжение холостого хода 42  
Сварочный ток 40 — 200  
Скорость подачи проволоки 2-15  
Диаметр проволоки 0.6 — 1  
Режим работы при 40° 40  
Степень защиты IP21  
Температурный диапазон работы -20 ; +50   
Габаритные размеры 482х197х466  
Вес 17.5   
Производитель Aurora

 

Инверторный сварочный полуавтомат Aurora PRO OVERMAN 200 (MOSFET)

Рассрочка на 6 месяцев.

Это именно рассрочка.

Процент по Кредиту мы возьмем на себя.

Вы можете указать в графе сумма — общую сумму по любым товарам.
Просим вас оформить заказ через корзину на самовывоз, чтобы мы могли Вас в дальнейшем включить в розыгрыш товаров или сделать подарок (при прохождении таких акций).
 

 

Инверторный сварочный полуавтомат Aurora PRO OVERMAN 200 (MOSFET)

Сварочный инвертор AuroraPRO OVERMAN 200 предназначен для полуавтоматической сварки в среде защитного газа MIG-MAG, а так же для работы с порошковой самозащитной проволокой в режиме NO GAS. . Благодаря продолжительному режиму работы на максимальных токах аппарат прекрасно подходит для работы как на бытовом так и на профессиональном уровне. В гараже, в автосервисе, на производстве — везде ОВЕРМАН 200, будет проявлять себя прекрасным и надежным помощником в деле. Overman 200 показал неплохие результаты при работе с алюминием. Мы рекомендуем этот аппарат для бытовой и полупрофессиональной сварки данного металла. Нагляное управление всеми важными параметрами сварки на лицевой панели позволит настроить полуавтомат для выполнения широкого спектра сварочных работ. Отдельным плюсом аппарата является возможность сварки в сетях с большими просадками питающего напряжения —  OVERMAN 200 способен работать при падении напряжения до 140 вольт. 

Особенности:

  • регулировка сварочного тока
  • регулировка сварочного напряжения
  • регулировка индуктивности для настройки желаемой жесткости дуги, глубины провара и формы валика
  • уверенная сварка алюминия
  • розетка 36В для подключения подогрева редуктора
  • настройка скорости протяжки проволоки: быстрая / медленная
  • высокая стабильность горения дуги, снижение образования брызг
  • работа при пониженном напряжении питающей сети — до 140В вольт
  • усовершенствованная технология инвертора MOSFET на базе транзисторов FUJI

Характеристики

Напряжение питающей сети 220 В
Потребляемая мощность 5.6 кВт
Рекомендуемая мощность генератора 7.7 кВА
Потребляемый ток 35 А
cos φ 0.73  
Напряжение холостого хода 42 В
Сварочный ток 40 — 200 А
Скорость подачи проволоки 2-15 м/мин
Диаметр проволоки 0.6 — 1 мм
Режим работы при 40° 40 %
Степень защиты IP21  
Температурный диапазон работы -20 ; +50 °C
Габаритные размеры 482х197х466 мм
Вес 17.5 кг
Производитель Aurora

Сварочный Полуавтомат Aurora Pro Overman 200 Цена 35 000 ₽. (ПрофСибирь)

Описание

Напряжение питающей сети 220 В
Потребляемая мощность 5.6 кВт
Рекомендуемая мощность генератора 7.7 кВА
Потребляемый ток 35 А

 

Технические характеристики:

Напряжение питающей сети 220 В
Потребляемая мощность 5.6 кВт
Рекомендуемая мощность генератора 7.7 кВА

Потребляемый ток 35 А
Напряжение холостого хода 42 В
Сварочный ток 40 — 200 А
Скорость подачи проволоки 2-15 м/мин
Диаметр проволоки 0.6 — 1 мм
Режим работы при 40* 40%
Степень защиты — IP21
Температурный диапазон работы -20 +50 *C
Габаритные размеры 482х197х466 мм
Вес 15 кг

Дополнительная информация:

Сварочный инвертор AuroraPRO OVERMAN 200 предназначен для полуавтоматической сварки в среде защитного газа MIG-MAG, а так же для работы с порошковой самозащитной проволокой в режиме NO GAS. . Благодаря продолжительному режиму работы на максимальных токах аппарат прекрасно подходит для работы как на бытовом так и на профессиональном уровне. В гараже, в автосервисе, на производстве — везде ОВЕРМАН 200, будет проявлять себя прекрасным и надежным помощником в деле. Overman 200 показал неплохие результаты при работе с алюминием. Мы рекомендуем этот аппарат для бытовой и полупрофессиональной сварки данного металла. Нагляное управление всеми важными параметрами сварки на лицевой панели позволит настроить полуавтомат для выполнения широкого спектра сварочных работ. Отдельным плюсом аппарата является возможность сварки в сетях с большими просадками питающего напряжения — OVERMAN 200 способен работать при падении напряжения до 140 вольт.

Особенности:

регулировка сварочного тока
регулировка сварочного напряжения
регулировка индуктивности для настройки желаемой жесткости дуги, глубины провара и формы валика
уверенная сварка алюминия
розетка 36В для подключения подогрева редуктора
настройка скорости протяжки проволоки: быстрая / медленная
высокая стабильность горения дуги, снижение образования брызг
работа при пониженном напряжении питающей сети — до 140В вольт
усовершенствованная технология инвертора MOSFET на базе транзисторов TOSHIBA

Применение:

авторемонт
строительство
небольшое производство
монтаж металлоконструкций
 

Производитель Aurora
Артикул 13709

Комментарии

Нет комментариев

Сварочный полуавтомат Aurora OVERMAN 200

Сварочный полуавтомат OVERMAN 200 — это очень надежный и самое главное крайне простой в эксплуатации сварочный аппарат предназначенный специально для полуавтоматической сварки в среде защитного газа MIG-MAG. Данный аппарат идеально подходит для работы на производстве или в автосервисе благодаря длительному режиму работы на максимальном токе.  На лицевой панели аппарата установлен цифрой дисплей отображающий важнейшие параметры сварки, которые в свою очередь достаточно сильно облегчают настройку и контроль сварочного процесса. Так же отдельно стоит отметить возможность сварки в сети с большой просадкой питающего напряжения. 

Особенности:
  • регулировка сварочного тока
  • регулировка сварочного напряжения
  • регулировка индуктивности для настройки желаемой жесткости дуги, глубины провара и формы валика
  • уверенная сварка алюминия
  • розетка 36В для подключения подогрева редуктора
  • настройка скорости протяжки проволоки: быстрая / медленная
  • высокая стабильность горения дуги, снижение образования брызг
  • работа при пониженном напряжении питающей сети — до 140В вольт
  • усовершенствованная технология инвертора MOSFET на базе транзисторов FUJI
Комплектация:
  • в комплекте с аппаратом идёт горелка — 1 шт. 
  • кабель 16mm 2,3 метра — 1 шт.
  • зажим на массу 300 А — 1 шт.
  • газовый шланг (с комплектом хомутов) 3 м. (9 мм) — 1 шт. 
Основные характеристики
Напряжение питающей сети 220В
Потребляемый ток 35 А
Рекомендуемая мощность генератора 7.7 кВа
MMA сварка
Потребляемая мощность 5.6 кВт
Напряжение холостого хода 42 В
MIG/MAG сварка
Максимальный сварочный ток в режиме MIG/MAG 200 А
Минимальный сварочный ток в режиме MIG/MAG 40 А
Диаметр сварочной проволоки 1 мм
Дополнительно
Диапазон рабочих температур -20 ; +50
Степень защиты IP21
Скорость подачи проволоки 2-15 м/мин

Инверторный полуавтоматический сварочный аппарат Квазаррус МиГ 200 – купить по низким ценам в интернет-магазине Joom

Основные характеристики Наименование: Сварочный аппарат FoxWeld Kvazarrus MIG 200 (6611) * электрический * инверторный • полуавтоматический (MIG/MAG), ручная дуговая сварка (MMA) * эл. Торговая марка: ФоксВелд Категория: Рабочие инструменты & raquo; Сварочные аппараты-инверторы & raquo; Сварочные аппараты-инверторы Код производителя: 6611 Штрих-код: 46071721 Описание:

КВАЗАРРУС МИГ 200 — современный полуавтоматический инвертор, выполненный по современной IGBT-технологии.оптимален для ремонтных работ в wo Производитель: ФоксВелд Семья: Квазаррус МИГ Модель: 200 Код производителя: 6611 Эан: 46071721 Тип поставки: коммерческая упаковка Номер 1 Тип упаковки: картонная коробка Количество в упаковке: 1 шт. Страна производитель: Китай Тип: сварочный аппарат Применение: для строительства/ремонта Материал: металл Цвет: оранжевый черный Свойства/функции: displaydigits позволяют отображать элементы параграфа pianificatori. Инструмент: электрический Класс устройства: профессиональный По материалу: на металле Тип сварки/резки: инвертор Способ сварки: полуавтоматическая (MIG/MAG), ручная дуговая сварка (MMA) Материал/характеристики сварки/резки: электрод • основной электрод с покрытием * диаметр от 1.Электрод от 6 мм до 4 мм • Электрод с рутиловым покрытием • Диаметр от 1,6 мм до 4 мм Сварочный ток (постоянный), А: 20 — 200 Рабочий цикл: 200А/60% Класс защиты: IP 21S Свойства/особенности: защита от перегрева (OTP) скорость подачи проволоки регулятор индуктивности регулятор напряжения регулятор сварочного тока регулятор IGBT tec Входное напряжение: 220 В Частота переменного тока: 50 Гц Количество фаз: 1 Класс изоляции: H Температура: от -10 °C до 40 °C Влажность: 0 — 90 % Размеры/вес: сварочный аппарат • 20 см x 30.5 см x 44,5 см • 9,7 кг В комплекте: 1 x зажим • для заземления 200 А с кабелем 1,25 м 1 x горелка * для полуавтоматической сварки с держателем шланга 3 м 1 x руководство пользователя 1 Ширина, см: 30 Рост, см: 32,5 Глубина, см: 50,5 Вес, кг: 14

Тип товара: Сварочное оборудование

27 ноября Аукцион огнестрельного оружия – Cornwell, Inc. | Аврора, NE

РУЖЬЯ

РЕМИНГТОН 870-12G; 870 Ствол 2 3/4 импр. цил. 26”; 870 Ствол 3″ Модифицированный 30”; 870 Syn Black Tac 12ga NIB; Ловушка 870 ТБ 12ga 34”; Модель 1100 12ga Auto 28″ Brl; Модель 1100 20ga.Автозарядка СГ; Модель 1100 Ствол 2 3/4 полный чок 28”; Модель 1100 Ствол 2 3/4 Мод. 28”; Спортинг 28 1100 28ga. автозагрузка; Насос Wingmaster 870 12ga; -11 Спортсмен-12 г

ВИНЧЕСТЕР ; 42-410; -97-12г; -Черный бриллиант M97-12G; Модель 97 12ga SG Trap Full Choke;

ПРОЧИЕ; Benelli Super Black Eagle 12ga Semi Auto Camo; Браунинг BT-99 12ga 2 3/4 34″ ствол; Браунинг Сильвер Хантер 20ga 3″ с автозарядкой; Двойной ствол CVA 12ga; Ивер Джонсон 410ga Single Shot; JC Higgins Model 94C 16ga Single Shot; Keltec KS7 12ga Авто; Моссберг Модель 195 12ga.Затвор; Stevens 410ga Single Shot  

АВТОМОБИЛЬ

Ford Mustang 1966 года, 6 цилиндров, 4 скорости, 84 тыс. миль – 13:00

БОЕПРИПАСЫ; Тысячи патронов, связанных с обширным огнестрельным оружием, предлагались

ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ДЛЯ ОРУЖИЯ; Оружейный сейф Freedom, оружейный сейф Cabela — нужна новая дверь, сигнальная пушка, тиски Midway Shooters, наплечный упор для винтовки, много кобур; Несколько чехлов для оружия, мягкие и жесткие,

НОЖИ; Обширная коллекция ножей, включая следующие ; Пользовательский FU Richtig Clarkson, NE, J.Moore Damascus 6,5″ и 7,5″, J Moore Custom Bowie, Несколько Gil Hibben, Ruk — Испания, Winchester, Lerado, Colt, Blackjack Acconda III, Damascus, Wildcat Germany, Browning Horse Hair в футляре, CG Co. Soligen Germany w /ножны, Marbles, Puma Hunters Pal, Bowie, Buck, Shepler Damascus 1970-х, Other Pocket Knives и другие

ПИВНЫЕ СВЕТИЛЬНИКИ; Budweiser Revolving Parade Clydesdales Light * Budweiser Salutes Nebr. «N» Neon * Budweiser Guitar Neon * Miller Genuine Draft Neon

КРЕПЛЕНИЯ; Большой олень, большой карибу, африканский водяной олень, олень, канадский гусь, фазан, 2 шкуры,

ПРОЧИЙ АНТИКВАРИАТ / КОЛЛЕКЦИОННЫЕ ПРЕДМЕТЫ; 2 утяжеления Dempster для ветряной мельницы с коротким хвостом; Дубовый шкаф, изогнутый стальной сейф, United Horse Clock с оригинальной биркой, коллекция 2 наконечников стрел в рамке

Новости фотографии Кена Роквелла

Главная  Пожертвовать  Новый   Поиск  Галерея  Обзоры  Как сделать  Книги  Ссылки  Семинары  О нас Контакты

Nikon, Canon и Sony Полнокадровые беззеркальные камеры   Беззеркальные камеры и DSLR

Canon: EOS R3 R5 R5C R6 R RP 1DX III 1DX II 5DS/R 5D Mk IV 6D II 90D T8i SL3 Объективы для вспышки

Nikon: Z9 Z7 II Z6 II Z7 Z6 Z5 Z fc Z50 D6 D5 D850 D780 D750 D500 D7500 D5600 D3500 Объективы со вспышкой Лучшие объективы Nikon

Sony: A1 A9 II A9 A7R IV A7R III A7 IV A7 III A7R II A7S III A7c A7 II A6600 A6400 A6100 A6000 ZV-E10 RX10/4 RX100/7 RX100/6 Объективы

Fujifilm : GFX100S GFX100 GFX50R X100V X100F X-T4 X-T3 X-T30 X-Pro3 X-S10 X-E4 X-T200 Пленочные объективы

LEICA: SL2 SL-2 S Q2 Q2M M10-R M10M M10P M10 M240 M-E M9P M9T M9 M7 M6/TTL CLE M3 IIIf IIIa Объективы

Все отзывы: Apple Audio Zeiss Tamron Sigma Tokina Hasselblad Contax Olympus Pentax Yosemite 2021

Рекомендуемые камеры  Лучшие камеры  Подарки   Как делать более качественные снимки   случайный

Ссылки:  Adorama  Amazon  B&H  Crutchfield  eBay  Как выиграть на eBay  Обучающие видео  Think Tank   Инфракрасный

Ежедневные предложения Adorama   Ежедневные предложения Amazon

Отдел продаж Crutchfield   Зона сделок B&H

YouTube  Instagram   Facebook  Twitter

Райан Кэти RSS

 

Распродажа ко Дню святого Валентина на курсах фотографии Фила Стила

Мой друг Фил Стил устраивает распродажу своих курсов.Учебники Фила — лучшее, что я видел; посмотрите его превью и убедитесь сами. У него есть 60-дневная гарантия возврата денег без риска, так что вам нечего терять, и вы можете получить все. Вы можете смотреть их где угодно и где угодно, гораздо лучше, чем в книге, файле или электронной книге.

Скидка 30%: Понимание вашей камеры.

Скидка 33%: улучшенная выносная вспышка.

Скидка 33%: секреты успешной фотосъемки мероприятий.

Скидка 30%: Lightroom — это просто.

Скидка 30%: основы Photoshop для фотографов.

Скидка 30%: профессиональные портреты с выносной вспышкой.

Фил имеет 60-дневную гарантию возврата денег, так что вы не можете позволить себе не попробовать.

 

03 февраля 2022, четверг

В наличии: Sony A7 IV.

 

Новинка: Zoom Q8n-4K Handy Video Recorder.

Камера 4K со специальной микрофонной системой X-Y наверху.

 

Новинка: Софтбоксы Angler Strip, 12” x 55” и 10” x 24”.

Купите сейчас, и они поставляются с бесплатной сеткой (стоимостью 45 долларов США).

 

Новинка: Impact Deluxe Varipole Support System с комплектом металлической цепи.
 
Скидка до 250 долларов: Объективы Rokinon для беззеркальных камер.
Скидка 50 долларов: Мобильная установка JOBY GorillaPod.

 

22 февраля, День сурка

Стабилизация Canon EOS R3: ВАУ!

Canon EOS R3 и EF 50 мм f/1,0 L на адаптере EF-RF.

Боже мой, я только что проверил свою EOS R3 в своей лаборатории и был поражен улучшением на пять-шесть ступеней в реальном мире с моими нестабилизированными объективами EF за счет стабилизации сдвига сенсора моей EOS R3 .

Камера EOS R3 обладает, безусловно, лучшей стабилизацией, которую я когда-либо измерял, что позволяет делать четкие снимки с расстояния 300 мм (90 233 с рук) за одну секунду (90 234) и резкие снимки с рук (90 233) за 4 секунды (90 234) с 80 мм!

Я никогда не видел такой хорошей стабилизации, и это с нестабилизированными объективами EF:

Односекундная экспозиция с рук в эквиваленте 300 мм: некоторые книжные полки Роквелла, 12:09, вторник, 1 февраля 2022 г. Canon EOS R3, снято с качеством JPG 4, Canon EF 180mm f/3.5L Macro USM (эквивалент 300 мм, как снято здесь с кропом 1,6x) на адаптер EF-RF при f/7.1, снято с рук за одну секунду при Auto ISO 100 (LV 5,6). файл в формате JPG (2 МБ) в большем размере или с камеры ©.

 

Четырехсекундная экспозиция с рук в эквиваленте 80 мм: Some of Rockwell’s Bookshelves, 12:01, вторник, 1 февраля 2022 г. Canon EOS R3, снято с качеством JPG 4, Canon EF 50mm f/1.8 STM (эквивалент 80 мм, снятый здесь с 1,6-кратным кадрированием) на адаптере EF – RF при f/10 при съемке с рук в течение 90 233 четыре секунды 90 234 при ISO 50 (LV 5,6). файл в формате JPG (3 МБ) в большем размере или с камеры ©.

 

01 февраля 2022, вторник

Новинка на Кратчфилде: Canon EOS R5 C с 24-105 мм.
Новинка от Crutchfield: Canon DR-E6C Переходник постоянного тока для камер EOS RC.

Насколько я могу предположить, это только переходник, без адаптера переменного тока, как показано на рисунке.

 

31 января 2022 года, понедельник

СКИДКА 2400 $: 50 Мп Canon 5DS/R: всего 1499 $!!!

Мне нравится мой 5DS/R, и я заплатил полные 3900 долларов, когда он вышел.

Беззеркальная камера

— это весело, но моя 5DS/R по-прежнему имеет самое высокое разрешение среди всех моделей Nikon или Canon.

Беззеркальные камеры привлекают все внимание прессы, потому что за ними стоят все рекламные доллары, но если вы хотите получить лучшие фотографии, на которые только способны, приобретите Canon 5DS/R по льготной цене, пока можете, и никогда не оглядывайтесь назад.

 

РАСПРОДАЖА: Специальные предложения Суперкубка.

 

29 января 2022, суббота

Nitecore BlowerBaby .

Новинка: Обзор Nitecore BlowerBaby.

Маленькая симпатичная перезаряжаемая груша, которую можно положить в сумку.

 

25 января 2022 года, вторник

Райану понадобился новый снимок для школьного проекта, поэтому после того, как мы вчера вернулись домой после стрижки, мы пробрались на задний двор в последних лучах солнца, когда солнце скрылось за горами.Это был первый выстрел из 15, и он был лучшим. мне повезло; Мне не понадобилась пленка, чтобы затемнить прямые солнечные лучи, потому что гора сделала это за меня, а моя встроенная в камеру вспышка Canon 580EX II (приблизительно 75 долларов США, если вы знаете, как выиграть на eBay) гарантировала, что тени не станут слишком яркими. темно.

Райан, 16:39. Canon EOS R3, Canon EF 100-400mm IS L II на адаптере EF-RF на 330 мм, широко открытая камера, f/5,6, съемка с рук, 1 / 250 , ISO 320 (LV 11⅓), Canon 580EX II вспышка на камере, Perfectly Clear для оптимизации глаз, кожи и зубов одним щелчком мыши.больше или по размеру экрана.

Я снимал с расстояния примерно 15 футов (4,5 метра) и увеличивал масштаб до 330 мм, так как это то, что я делаю, чтобы получить естественную передачу лица; съемка с близкого расстояния с объективом 105 мм не будет выглядеть так же. Худшее, что произошло за последние два года, это то, что весь мир показывает себя с расстояния вытянутой руки с автопортретами и камерами ноутбуков; вам нужно находиться на расстоянии около 15 футов (4,5 метра), чтобы лица выглядели естественно.

Я держал камеру вертикально и намеренно держал ее так, чтобы вспышка была слева, так как солнце светило немного справа.

Я установил на своем EOS R3 программную экспозицию, большой JPG (качество 4), автоматический ISO, автоматический баланс белого, портретный стиль изображения и установил силу резкости на 7. Все остальные параметры были оставлены по умолчанию; наведи и стреляй.

 

Скидка 250 долл. США: SanDisk Extreme Portable SSD V2 емкостью 4 ТБ (1000 МБ/с): 549,99 долл. США.

Я купил себе на Рождество версию на 2 ТБ, и это ПОТРЯСАЮЩЕ!!! Это крошечный, неразрушимый сверхбыстрый накопитель. Он меньше, чем любой другой портативный жесткий диск, на нем можно хранить всю информацию, и он работает так же быстро, как внутренний твердотельный накопитель вашего ноутбука, и намного быстрее, чем любой встроенный жесткий диск.

На моем внешнем SSD я могу не только быстро создавать резервные копии, хранить и передавать огромные фото- и видеобиблиотеки, у меня есть другие тома с загрузочными копиями моего настольного Mac Pro, так что я могу запускать свой ноутбук, как если бы это был мой настольный Mac с все его данные и программы, а также иметь доступ ко всем своим файлам в любом месте в поле. (Конечно, я не пользуюсь удаленным доступом через Интернет, потому что если я могу подключиться к своему Mac через Интернет, то и все остальные смогут!) Портативный твердотельный накопитель плоский, его сторона составляет всего пару дюймов.У меня также есть другие загрузочные тома с разными версиями операционной системы Mac, так что я могу попробовать их.

Я использовал Super Duper для создания загрузочных копий всех моих дисков в качестве резервных копий каждый день в течение последних 20 лет. Лучшие 28 долларов, которые я когда-либо тратил. Я купил его один раз 20 лет назад, и с тех пор у меня были бесплатные обновления.

Подсказка: я заплатил больше за версию Extreme PRO, рассчитанную на 2000 МБ/с, но реальная скорость ограничена вашим оборудованием, интерфейсом и выбором кабеля. Я измеряю только 950 МБ / с, напрямую подключенный к порту Thunderbolt 3 моего MacBook Pro 2017 года 40 Гбит / с с помощью кабеля Thunderbolt, поэтому я не буду платить больше за версию PRO в следующий раз; версия 1000 МБ/с, скорее всего, будет работать так же быстро.

 

Скидка 75 долларов: Комплект штативов Manfrotto MT190CXPRO3.
 
Скидки на камеры Panasonic.
Скидки на объективы Panasonic.

 

Распродажа: Luminar Neo предзаказ .
Продажа: Luminar AI .
Распродажа для тех, у кого уже есть Luminar AI или Aurora HDR: Luminar Neo и бесплатный HDR .

Я использую Luminar AI для добавления облаков; он также редактирует кожу и глаза людей, уменьшает жир и многое другое.Я использую Aurora HDR, чтобы превратить мои фотографии из плана в безумие!!! как вы можете видеть на моих снимках Йосемити.

Предложения действительны до понедельника, 31 января 2022 года.

 

22.01.22, суббота

Скидка 400 долларов: Nikon Z6: 1596,95 долларов .
Скидка 200 долларов: Fuji X-T4: 1499,95 долларов .
Скидка 70 долларов: Bluetooth-наушники Sennheiser HD 450BT с шумоподавлением: 129,95 долларов .
Новинка на Кратчфилде: Canon EOS R5C .

 

19 января 2022 года, среда

Новинка: Canon EOS R5C 45MP для фотосъемки и цифровой кинокамеры 8K . (Также в Адораме и Кратчфилде.)

Canon EOS R5C . больше.

 

Canon EOS R5C . больше.

Добавляет охлаждающий вентилятор и другие функции кинокамер Canon в EOS R5.

 

Новинка: Nikon Z 400mm f/2.8 ВР . ( Также в Adorama .)

Nikon Z 400mm f/2.8 VR на Z9. больше.

 

Nikon Z 400 мм f/2,8 VR . больше.

 

Переключатель телеконвертера. Просто переверните его, чтобы включить или отключить внутренний преобразователь. больше.

Он весит всего 6,45 фунтов (2950 г) и имеет встроенный 1.4х телеконвертер. Поверните рычажок сзади объектива, чтобы поставить его на оптический путь, и BINGO!, 560mm f/4! Переверните рычаг назад, и БИНГО! , обратно к 400мм f/2.8! Вау!

Мой AF-I 400mm f/2.8, который я купил в 1990-х годах, не имеет VR и весит 14 фунтов (6600 г), поэтому я не хотел носить или использовать его с тех пор, как получил свой первый AF-D 80-400mm VR в 2004 году!

Когда вы снимаете весь день, никогда не недооценивайте ценность легкого объектива.

Еще одна причина, по которой я рад, что перешел на Canon в 2012 году, заключается в том, что мой AF-I 400mm f/2 1990-х годов.8 работает только с FTZ/II, а мой первый AF-D 80-400mm VR вообще не будет автофокусироваться на FTZ/II. Тысячи и тысячи долларов, которые я вложил, сейчас сгорели, в то время как все моих объектива Canon EF работают безупречно на моей беззеркальной камере Canon, особенно на моем EF 300mm f/2.8L 1988 года и EF 80-200mm f/2.8L 1989 года, оба из них теперь добавляют стабилизацию изображения на мои EOS R3, R5 и R6!

 

Новое: капот HK-42. (в комплекте).

Новинка: мягкий чехол CL-L3. (в комплекте).

Новинка: передняя крышка объектива LC-K105. (в комплекте).

Новинка: ремешок для объектива LN-3. (в комплекте).

Новинка: вставной поляризатор C-PL 460. (извините, не входит).

 

18 января 2022 г., вторник

Самое время: фотографии из Йосемити и Восточной Сьерры .

Это мои снимки из поездки, которую я помогал провести в октябре.

Начал я на них, потом случились праздники, как раз в это время я обзавелся новым классным софтом (Skylum Aurora HDR и Skylum Luminar AI). Это новое программное обеспечение, особенно Aurora HDR, сделало многие из моих изображений настолько лучше, что я вернулся к началу и переделал многие из них.

Из-за этого и обычных праздничных развлечений мне потребовалось три месяца, чтобы поделиться некоторыми фотографиями. Наслаждаться!

 

13 января 2022 г., четверг

LEICA M11 с объективом SUMMILUX-M 50mm f/1.4 АСФ.

Скажу так: впервые с незапамятных времен LEICA наконец достигает 11.

60 МП.

Только 0,73-кратное увеличение искателя.

Нет видео, слава богу.

Он имеет настройки с более низким разрешением 36 МП и 18 МП, которые аналогичны цифровым камерам с 1990-х годов. LEICA была просто достаточно умна, чтобы придумать это, заявив о волшебном уменьшении шума и расширении динамического диапазона.Ну, может быть — но это такие же мелкие улучшения, которые происходят в каждой цифровой камере, когда вы снимаете их с более низкими настройками разрешения. На самом деле, вы получаете те же преимущества, когда позже уменьшаете разрешение в Photoshop; Ничего страшного, но истинные заявления LEICA впечатляют тех, у кого нет докторской степени в области обработки цифровых изображений, и кто не понимает, что это применимо ко всем цифровым изображениям.

На самом деле, если они просто «бинируют» (не настоящее слово в DSP), это означает простое усреднение блоков, а не обычную бикубическую свертку, которую делают все остальные.Бикубическая свертка, как вы все знаете, более сложна и работает лучше для увеличения динамического диапазона и уменьшения шума, чем простое усреднение, но LEICA знает, что на самом деле вы этого не знаете. Игнорируйте это утверждение «Многоразрешение». Боже!

M11 выпускается в черном и серебряном цветах.

 

Принадлежности:

НЭУ: LEICA VISOFLEX 2.

 

NEU: Рукоятка.

NEU: Ручка для большого пальца, черная.

 

NEU: Ремешок, черный.

NEU: Ремешок коньячный.

NEU: ремешок, оливково-зеленый.

 

NEU: Половина футляра, черный.

NEU: Половина ящика, коньяк.

NEU: Полуфутляр, оливково-зеленый.

 

NEU: Защитная пленка для экрана.

 

Новинка на Кратчфилде: LEICA M11, черный .

Новинка на Кратчфилде: LEICA M11, серебро .

Новинка на Кратчфилде: LEICA VISOFLEX 2 .

Новинка от Crutchfield: рукоятка LEICA M11 .

Новинка от Crutchfield: полуфутляр LEICA M11, черный .

Новинка от Crutchfield: батарея LEICA M11, черный .

Новинка от Crutchfield: батарея LEICA M11, серебро .

 

NEU: кабель M11 — iPhone (USB-C — Lightning).

Подключите M11 к iPhone. Зачем беспокоиться? Я сделал этот снимок на своем iPhone 13 Pro Max еще в октябре:

.

Half Dome in Last Light, Cooks Meadow, Yosemite National Park, 18:12. Камера Apple iPhone 13 Pro Max 9 мм (экв. 77 мм), f/2,8, 1 / 122 , Auto ISO 50 (LV 10,9), Snapseed на iPhone для увеличения, Skylum Luminar AI на моем Mac для добавления облака и, наконец, Skylum Aurora HDR для добавления снимков и виньетирования, все из моего единственного оригинального файла JPG.больше или по размеру экрана.

 

Запчасти:

NEU: зарядное устройство M11.

NEU: Аккумулятор M11, черный.

NEU: Батарея M11, серебро.

 

Новинка на Кратчфилде: Nikon Z 28-75mm f/2.8 .

 

08 января 2022, суббота

Впервые в мире: RitzGear SDXC Express 7.0 256 ГБ 820/500 МБ/с Чтение/Запись: 199 долларов США.99 .

Самая новая SD-карта с самым быстрым рейтингом на планете, которая уже поступила в продажу.

Чтобы получить эту цену, обязательно выберите купон на скидку 100 долларов.

 

НОВИНКА: обзор док-станции OWC Thunderbolt 3 .

Передняя панель, док-станция OWC Thunderbolt 3.

 

Задняя панель, док-станция OWC Thunderbolt 3.

На Рождество я собрался, и Санта принес мне док-станцию ​​OWC Thunderbolt 3 для настольного использования с моим MacBook Pro 2017 года.Это самый быстрый считыватель SD-карт, который я тестировал, как показано в моем тесте скорости Hub & Card Reader.

По сравнению с дешевыми китайскими устройствами, которые я тестировал в декабре в тесте скорости концентратора и устройства чтения карт, эта профессиональная док-станция просто выполняет свою работу, и делает это хорошо и без сбоев. Это просто идет, как мы ожидаем. Один шнур подключается к моему MacBook Pro, и теперь у меня есть питание и множество подключенных дисков, устройств, Интернета и мониторов. Аккуратный!

 

07 января 2022, пятница

В наличии: Sony A7 IV .
В наличии: Sony A7 IV с 28–70 мм .
 
Новый комплект: Canon EOS-R с 128 ГБ Extreme PRO, микрофоном Røde, светодиодной подсветкой, футляром и т. д.: 1599 долл. США .
 
Скидка 200 долларов: Fuji XT-4: 1499,95 долларов .

 

05 января 2022, среда

 

Компактный цифровой монокуляр Canon PowerShot ZOOM со стабилизацией.

Новинка: Canon PowerShot ZOOM .

Карманный телеобъектив и телеобъектив.

 

Новинка: колонки B&W 702 S2.

Это здорово; B&H теперь предлагает эти динамики B&W. Я использую колонки B&W с 1990-х годов. У меня есть пара 805 на моем рабочем столе, используемая со стереопарой сабвуферов ASW 800 за моим столом для моего компьютера, 802 и стереопара сабвуферов ASW 850 в моем кинотеатре и пара 801 в моей музыкальной комнате. Браво!

 

29 декабря 2021, среда

В наличии: Sony a7 IV с 28-70 мм: 2698 долларов США.

В наличии: Canon T8i: $749.

В наличии: Nikon Z 28mm f/2.8: 296,95 долларов США.

В наличии: Видеокамера Canon XF605: 4 499 долларов США.

В наличии: Рюкзак Tenba DNA 16: 219,95 $.

 

B&H устраивает мегараспродажу. А еще у них мега распродажа аксессуаров. Большинство таких сделок заканчивается 29 числа.

Например, некоторые из многих сделок:

Скидка 55 долларов США: SD-карта SanDisk Extreme PRO емкостью 128 ГБ: 24 доллара США.99 . (скидка применяется в корзине; например, на Amazon она составляет более 30 долларов США.)

 

25 декабря 2021,

C Рождество День !!!!

С Рождеством С Рождеством Всем!!!

 

23 декабря 2021, четверг

Новинка: измерения стабилизации Canon EF 100-400 мм L IS II .
Новое: Canon EF 28-135 мм измерения стабилизации IS. Я протестировал в лаборатории два моих любимых объектива, чтобы проверить, насколько хорошо они стабилизируются на моей стабилизированной камере EOS R5.
 
Новинка: адаптер Canon EF to RF 0,71× Cinema Mount.

Предназначен для использования полнокадровых объективов EF на камерах Canon Super 35 Cine. Он добавляет стоп скорости и позволяет вам использовать большую часть угла обзора объектива с обрезанным датчиком Super 35.

 

22 декабря 2021 года, среда

Предложения последнего шанса в B&H.

Все закончится сегодня в полночь по нью-йоркскому времени (9 вечера по западному побережью).

 

Новинка: Зеленый выдвижной фон Angler Chroma.

Новинка: Impact 8 x 10′ Складной белый фон.

Новинка: Комплект двухцветных светодиодных кольцевых ламп Angler 14 дюймов. 

Новинка: Складной двухцветный фонарь-кольцо Raya 18″ Bendie-Brite.

 

20 декабря 2021, понедельник

Canon RF 100~400 мм IS USM.

Новинка: Canon RF 100-400mm IS USM Обзор.

Невероятно резкий, быстро и близко фокусирующийся объектив по сверхнизкой цене.

 

Скидка 2000 долларов: Canon 1DX Mk II: 3999 долларов .

 

Рыбий глаз, 220 градусов: Редкий объектив Nikon 6mm f/5.6 на eBay.

Эти классические объективы «рыбий глаз» с поднятым зеркалом сегодня отлично работают на беззеркальных камерах, намного лучше, чем когда-либо на зеркальных камерах.Вот мой обзор его 180º 8mm f/8 сестры.

Я никогда не покупал у этого продавца раньше, но мне кажется, что я видел их на протяжении многих лет, специализирующихся на подобных сумасшедших вещах.

 

Скидка 160 долларов: Карта памяти SanDisk Extreme PRO CFast 2.0 на 128 ГБ: 139,99 долларов.
Скидка до 510 долларов: Камера Panasonic GH5 и комплекты.
Скидка до 100 долларов: LaCie Rugged Portable SSD.
Скидка 120 долларов: Mevo Start Комплект из 2 камер для прямой трансляции с 2 настольными подставками и ящиками для хранения: 899 долларов.94.

 

18 декабря 2021, суббота

Попался!

Читатели заметили, что Nikon Z 28-75mm f/2.8 выглядит как тот же объектив, что и Tamron 28-75mm f/2.8 для Sony E.

Я провел исследование, и, хотя он очень похож на Tamron 28-75mm f/2.8 Di III VXD G2 (модель A063), Tamron имеет другую оптическую схему: 17 элементов в 15 группах против 15 элементов Nikon в 12 группах.

Я провел расследование, потому что именно я более 15 лет назад первым сообщил новость о том, что Nikon AF Nikkor 70-300mm f/4-5 был очень популярен в то время.6D ED действительно казался идентичным Tamron 70-300.4-5.6, так что сегодня это было заслуживающим доверия обвинением.

Хотя объективы для аналогичных целей часто имеют очень похожие характеристики и внутренние схемы, которые выглядят очень похоже, поскольку разработчики оптики любой эпохи обычно разрабатывают аналогичные объективы на основе одной и той же базовой оптической структуры, фактические продукты действительно являются разными продуктами разных компаний. Я уложил эту спать.

Продолжали поступать обвинения, и, наконец, кто-то пояснил, что объектив Nikon — это не новейший A063 G2 Tamron, а действительно старый, устаревший Tamron 28-75mm f/2.8 Di III RXD для Sony E (модель A036)!

Святая корова, мне никогда бы не пришло в голову заглянуть на кладбище Tamron (я художник, который должен зарабатывать на жизнь созданием захватывающих изображений, а не исследователь камеры), но да, все в этих двух объективах похоже, все то же самое, вплоть до весов и кривых MTF.

Возможно, из-за того, что это устаревший объектив Tamron, не так много было сделано, чтобы отмыть проблему, но обычно, когда разыгрываются эти шутки, каждый производитель показывает внутреннюю схему конструкции объектива с объективом, установленным на другое фокусное расстояние, что меняет положение объектива. элементы, чтобы скрыть пятно всего этого.

Вот характеристики Nikon и диаграммы MTF, а вот данные Tamron по их старому объективу, который сегодня можно купить только б/у.

Ну и что, что это один и тот же объектив? Может быть, Nikon производит дизайн по лицензии, или, может быть, Tamron делает их для Nikon. Это не имеет значения; Я все еще заказал свой Nikon Z 28-75mm f/2.8 по нескольким более и менее очевидным причинам:

.

1.) Конечно, я могу купить старый Tamron на eBay за половину цены (550 долларов, если вы знаете, как выиграть на eBay), но старый Tamron поставляется только с байонетом Sony E, поэтому он никоим образом не может заменить Nikon Z 28-75мм f/2.8.

2.) Несмотря на то, что у старого объектива Tamron был байонет Nikon, небрендовые объективы не являются долгосрочными инвестициями, как я. Когда я покупаю объектив для камеры, я знаю, что он будет работать с новыми камерами (например, с моей Z9), когда эти новые камеры появятся. Это чушь с небрендами относительно того, будут ли они работать должным образом на новых моделях камер.

3.) Даже если бы я предпочел купить новейший Tamron A063 G2 за 899 долларов, новый Tamron также поставляется только с байонетом Sony, так что вернемся к правилу номер один выше.

 

16 декабря 2021, четверг

В наличии: Sony A1.

 

Еще предложения:

Скидка до 500 долларов на Nikon .

Пятикратное увеличение вознаграждения за фотооборудование в Adorama.

Праздничные подарки в Adorama.

 

Я все еще работаю над своими октябрьскими фотографиями из Йосемити. Вот еще два:

Мерцающие осины, Tioga Pass Road, 12:25.M, 18 октября 2021 г. Камера Apple iPhone 13 Pro Max 9 мм (экв. 77 мм) с f/2,8 при 1 / 315 при Auto ISO 32 (LV 12,9), Perfectly Clear, Skylum Aurora HDR из моего единственного JPG расстрелянный, расколотый принт. больше или по размеру экрана.

 

Golden Aspen, Тиога-Пасс-роуд, 12:49, 18 октября 2021 г. ISO 100, -0.7 ступеней компенсации экспозиции (LV 13,6), Skylum Aurora HDR, чтобы подчеркнуть темно-зеленые тени из моего единственного снимка JPG. больше, или в размер экрана, или оригинал камеры 45 МП © 9 МБ JPG.

 

15 декабря 2021 г., среда

Скидки на флэш-накопители

 

Карты

Скидка 43 долл. США: SanDisk 256 ГБ Extreme PRO SD: 56,99 долл. США.
Скидка 17 долларов: SanDisk 256 ГБ Extreme SD: 42 доллара.99.

 

Внешние твердотельные накопители USB-C

Скидка 90 долларов: Внешний твердотельный накопитель SanDisk Extreme 512 ГБ: 79,99 долларов.
Скидка 180 долл. США: Внешний твердотельный накопитель SanDisk Extreme емкостью 1 ТБ: 139,99 долл. США.
Скидка 90 долл. США: Внешний твердотельный накопитель SanDisk Extreme PRO емкостью 1 ТБ: 209,99 долл. США. (также на Амазоне.)
Скидка 170 долл. США: Внешний твердотельный накопитель SanDisk Extreme PRO емкостью 2 ТБ: 329,99 долл. США. (также на Амазоне.)
Скидка 260 долларов: Внешний твердотельный накопитель SanDisk Extreme PRO 4 ТБ: 739 долларов.99. (также на Амазоне.)

 

Флэш-накопители

Скидка 14 долларов: SanDisk 256 ГБ Extreme PRO USB Flash Drive: 58,99 долларов.
Скидка 29 долларов: SanDisk USB-накопитель на 512 ГБ: 50,99 долларов.

 

2,5-дюймовые твердотельные накопители SATA III

Скидка 110 долл. США: Твердотельный накопитель SanDisk ULTRA 2 ТБ: 179,99 долл. США.
Скидка 75 долларов США: SanDisk ULTRA 1 ТБ SSD: 89,99 долларов США.
Скидка 30 долларов: SanDisk ULTRA SSD 500 ГБ: 54 доллара.99.

 

Nikon Z 28-75мм f/2.8.

НОВИНКА: Nikon Z 28-75mm f/2.8 Обзор.

 

14 декабря 2021, вторник

Просто поддразнивание: Nikon Z 800mm f/6.3.

Просто больше горячего воздуха от Никон, Ни цены, ни доставки, ничего. Нехорошо дразнить, когда прошлым летом у меня уже был Canon RF 800mm! Птичникам это понравится, если они не перейдут на Canon, как это сделал я.

 

13 декабря 2021, понедельник

Вот несколько горячих предложений на сегодня. Как всегда они приходят и уходят; некоторые хороши только сегодня, и если вы знаете Нью-Йорк, все эти предложения приходят и уходят в зависимости от наличия и спроса от часа к часу, так что не откладывайте — например, B&H предлагает возврат до 1 февраля следующего года, так что не беспокойтесь о заказе. что вам нужно сейчас:

 

Зеленые предложения: Зеленый понедельник в B&H.

 

Скидка 300 долларов: Nikon AF-S 105mm f/2.8G ED VR Macro: 596,95 долларов.

Это действительно сделка; обычно это было около 800-900 долларов за последние десять лет.

 

Скидка 550 долларов: Canon 80D с 18-135 мм: 1149 долларов.

80D — потрясающая камера, а новейшая модель EF-s 18-135 USM IS USM поразительна; его двигатель фокусировки nano-USM обеспечивает мгновенную автофокусировку !

 

Скидка 500 долларов: Sony A7R IV A: 2998 долларов.

A7R IV — это самое высокое разрешение Sony! 2998 долларов? Сумасшедший!

Подробнее: Еще 8 пакетных предложений для A7R IV A. 
Скидка 300 долларов и скидка 100 долларов: Sony FE 24-105 мм f/4 G OSS: 998 долларов после скидки.
Скидка 200 долларов: Sigma 150–600 мм для Sony: 1299 долларов.

Заканчивается сегодня вечером, не медлите, если хотите свое.

 

Меньше половины цены: SanDisk 500GB Extreme Portable SSD: 79 долларов США.99.
Еще предложения: Внешние и внутренние твердотельные накопители SanDisk. Даже твердотельный накопитель емкостью 4 ТБ стоит 300 долларов!
Предложения: 16 различных предложений Samsung SSD.

 

Скидка 50 долларов: Комплект DJI Mavic 2 Fly More: 349 долларов.

 

Canon RF 100–400 мм IS USM

Мне нравится мой Canon RF 100-400mm IS USM, официальный обзор которого все еще находится в стадии подготовки, но что еще нужно знать? Автофокус почти мгновенный, сверхрезкий и удивительно четкий.Вот несколько снимков с субботы:

 

1956 Chevrolet, 9:30, суббота, 11 декабря 2021 г. как выстрел. больше или оригинальный файл камеры 45 MP © 6 MB JPG файл. Основное внимание уделяется логотипу и номерному знаку; защита бампера ближе и поэтому не в фокусе.

 

Небесно-голубой Oldsmobile, 9:33, суббота, 11 декабря 2021 г. Canon EOS R5, RF 100–400mm IS USM при 270 мм при f/9 при 1 / 320 при Auto ISO 100 (LV 14¾), точно так, как снято. больше или оригинальный файл камеры 45 MP © 9 MB JPG файл.

Это не искажение; это изогнутый капот.

 

Panther Pink Plymouth Hemi Barracuda Convertible 4 Speed, 9:40, суббота, 11 декабря 2021 г. 100, -0.7 ступеней компенсации экспозиции (LV 15,0), как при съемке. больше или оригинал камеры 45 MP © 10 MB JPG файл.

В центре внимания логотип Barracuda и задний фонарь; муха не в фокусе.

 

Teal Cadillac, 9:44, суббота, 11 декабря 2021 г. компенсация (LV 15.6), в точности как снято. больше или оригинальный файл камеры 45 MP © 18 MB JPG файл.

В центре внимания находится логотип Cadillac. Что касается того, что находится в фокусе, вы можете увидеть каждую искру в металлической краске.

 

Plum Crazy Purple Dodge, 13:45, 11 декабря 2021 г. 100, компенсация экспозиции -0,7 ступени (LV 14,0), Skylum Aurora HDR, чтобы подчеркнуть темные тени на моем единственном снимке JPG. больше или оригинальный файл камеры 30 MP © 6 MB JPG файл.

 

Cop Motor, Cop Tyres, Cop Suspension, Cop Shocks and Cop Hubcaps, 13:46, суббота, 11 декабря 2021 г. 1 / 160 при Auto ISO 100, -1 ступень компенсации экспозиции, чтобы черный цвет оставался черным (LV 14,4), как при съемке. больше или оригинальный файл камеры 30 MP © 7 MB JPG файл.

Фокус находится на левой стороне шины.

 

Красный Road Runner 1969 года, 13:54, суббота, 11 декабря 2021 г. Canon EOS R5 в режиме квадратной обрезки, RF 100-400 мм IS USM при 165 мм при f/9 при 1 / 400 при автоматическом ISO 100, -0,7 ступени Компенсация экспозиции для предотвращения перегрузки яркого красного цвета (LV 15,0) , точно как снято. больше.

Фокус на наклейке Road Runner.

 

Red Hot Road Runner 1969 года, 13:58, суббота, 11 декабря 2021 г. Canon EOS R5 в режиме кадрирования 4:5, RF 100–400 мм IS USM на 135 мм при f/6.3 при 1 / 200 при Auto ISO 100, -0,7 ступени Компенсация экспозиции, чтобы предотвратить перегрузку яркого красного (LV 13,0), как на снимке. больше.

Фокус находится на наклейке Road Runner над замком багажника.

 

Black Chrysler, 14:03, суббота, 11 декабря 2021 г. -1,3 останавливает компенсацию экспозиции, чтобы черные оставались черными (LV 14.0), Skylum Aurora HDR, чтобы отобразить получившиеся темные тени из моего единственного снимка JPG. больше или оригинальный файл камеры 30 MP © 6 MB JPG файл.

Видишь зеленое отражение в бампере? Это я.

 

Orange Challenger, 14:03, 11 декабря 2021 г. компенсация, чтобы яркий оранжевый цвет не перегружал красный канал (LV 14.1), обрезанный до квадрата, Perfectly Clear. больше.

Вот кадр из октября:

Мыльные пузыри с подсветкой, ранчо Нелли Гейл, 16:21, воскресенье, 24 октября 2021 г. 1 / 1000 при Auto ISO 640 (LV 13.0), Skylum Aurora HDR для поднятия темного фона. файл большего размера или исходный файл камеры 45 MP © JPG.

И вау, я забыл, что у меня был этот в прошлом месяце:

Пустынный рай на рассвете, 6:37, четверг, 18 ноября 2021 г. Canon EOS R5, RF 100-400mm IS USM при широко открытой диафрагме 183 мм при f/7.1 при съемке с рук при 1 / 125 при Auto ISO 100, -1 стоп компенсации экспозиции, чтобы не засветить красный канал с очень насыщенными красными тонами (LV 12.6), Skylum Aurora HDR для создания темного переднего плана, и все это из одного базового файла JPG. больше, в полном разрешении 45 Мп Файл 19 МБ или оригинальный файл камеры 45 Мп © 14 МБ файл JPG.

Фокус на линии ладоней. Достаточно острый для вас?

Да, мой RF 100-400mm IS USM такой же резкий, как и мой EF 100-400mm L IS II, но в разы меньше по размеру, весу и цене.

 

11 декабря 2021, суббота

Наконец-то! Новые обзоры от Rockwell!!!

Сегодня Красавица и Чудовище:

Canon RF 16 мм f/2,8 STM.

Новинка: Обзор Canon RF 16mm f/2.8 STM .

Один из самых инновационных объективов, представленных за последние годы; это позволяет нам делать больше с меньшими затратами, отвечая на призыв беззеркальных камер.

 

Митакон 90 мм f/1.5 для LEICA M.

Новинка: Обзор Mitakon 90mm f/1.5 .

Плохо сделанный объектив со спецэффектами и великолепным боке, который поставляется в креплениях для LEICA M, Canon RF, Nikon Z и Sony E.

 

09 декабря 2021, четверг

Новинка: Leica Q2 Reporter Edition .

Это тот же LEICA Q2, обтянутый тканым кевларом, а не кожей, и с удаленным красным значком LEICA.

 

Новое: Новая страница праздничных распродаж B&H.

 

Новинка: светодиодный светильник Ne Roto RGBAW.

Новинка: Rotolight NEO 3 LED Ultimate Light Kit.

Новинка: Rotolight NEO 3 LED Комплект из 3 ламп.

 

Новинка: светодиодный фонарь дневного света Godox Knowled M600D.

Новинка: линза Френеля Godox FLS8.

Новинка: Шторки Godox для линзы Френеля FLS8.

 

В наличии

Ricoh GR IIIx .

Зум-объектив Venus Optics Laowa 10–18 мм f/4,5–5,6 для Leica L.

Объектив Venus Optics Laowa 15mm f/2 FE Zero-D для Leica L.

Zhiyun-Tech CRANE-M3 3-осевой ручной карданный стабилизатор.

 

08 декабря 2021, среда

Есть в наличии

Sony E PZ 18-105 мм f/4 G OSS .

Sony FE 70–200 мм f/4 G OSS.

Объектив ZEISS Batis 25mm f/2 для Sony E.

Fuji XF 200 мм f/2 с телеконвертером 1,4x.

Фули Х-S10.

Объектив Fuli XF 23 мм f/1,4 R.

Камера Blackmagic Design URSA Broadcast G2.

Комплект камеры Blackmagic Design URSA Broadcast G2 с Fujinon LA16x8BRM-XB1A.

 

07 декабря 1941 г., 80-летие нападения на Перл-Харбор

Новые вкусности:

Новинка: штатив Oben ALF-6113L с шаровой головкой: 199 долларов США.95.

Новинка: Auray 5-секционная 7,7-дюймовая микрофонная штанга из углеродного волокна: 169,99 долларов США.

Новинка: микрофонная штанга Auray BP-47A 7,5 дюймов с внутренним кабелем XLR: 149,95 долларов США.

Новинка: 5-секционный микрофон Auray 7,7′ из углеродного волокна с внутренним кабелем XLR: 249,95 долларов США.

Новинка: магнитное крепление для фонаря, вмещает 100 фунтов: 28,95 долларов США.

Новинка: Крепление для двух мониторов Gabor: $99,95.

 

06 декабря 2021, понедельник

Скидка 500 долларов: Sony A7R IV A: 2998 долларов.
Скидка 300 долларов: Nikon AF-S 500 мм f/5.6E PF ED VR: 3 296,95 долларов.
Скидка 1300 долларов: Olympus E-M1X: 1699 долларов.
Скидка 400 долларов: Lumix GX85 с объективами 12–32 мм и 45–150 мм: 597,99 долларов.

 

Nikon AF-S 58 мм f/1,4 G .

Обновлено: Nikon AF-S 58mm f/1.4G.

Я обновил цены (сегодня всего 1447 долларов, а не 1700 долларов, когда он вышел в 2013 году) и оптимизировал размер страницы для новейших экранов.

 

Nikon AF-s 35mm f/1.4G.

Обновлено: Nikon AF-S 35mm f/1.4G.

Я обновил цены и оптимизировал размер страницы для новейших экранов.

 

05 декабря 2021, воскресенье

ПОДАРОК: Apple Watch Series 7.

Я все еще должен дать вам официальный обзор, и для тех из вас, кто знаком с Apple Watch, самое поразительное, что заставляет меня любить мою Series 7 по сравнению с моей старой Series 6, это то, насколько больше экран.

Хотя на бумаге корпус вырастает всего на один миллиметр, на самом деле дисплей намного, намного больше, так как теперь он выходит в стороны гораздо дальше, чем экран на старой Series 6.

Не смотрите на размер корпуса, на моем запястье он не кажется больше. Самое главное — это размер активного экрана, который увеличивается с 1,778 дюйма по диагонали до 1,918 дюйма по диагонали при одинаковом разрешении 326 точек на дюйм. Это для моей 44-мм Series 6 по сравнению с моей 45-мм Series 7, а также для размера эквивалентного прямоугольника, заполненного экраном с закругленными углами.Когда он такой маленький, важен каждый миллиметр.

Он также добавляет прямую QWERTY-клавиатуру, улучшенное отслеживание поездок на велосипеде и множество других вещей, но для большей части того, что я делаю, большой экран делает все намного лучше, что делает его отличным подарком для всех, у кого еще нет это новейшая версия Series 7, выпущенная всего 7 недель назад.

 

Скайлум Аврора HDR

Причина, по которой вы не видели много новых отзывов за последние пару недель, заключается в том, что я работал над своими фотографиями из Йосемити.Я делал их, а затем обнаружил Skylum Aurora HDR примерно на полпути. К сожалению, эта программа легко заставила мои изображения выглядеть даже лучше, чем мои окончательные правки, поэтому теперь мне нужно вернуться и заново запустить все через Aurora HDR.

Что замечательно в Aurora HDR, так это то, что я использую его как плагин к Photoshop (в моем случае CS6 2011 года), и он делает удивительные и автоматические вещи с моими отдельными изображениями JPG. Aurora HDR создан для таких чокнутых, как я, чтобы придать изображениям значительный WOW-фактор; вам не нужно снимать в необработанном виде или использовать более одного кадра за раз только потому, что это называется HDR.Я поражен тем, как первое изображение, которое я попробовал, автоматически получилось намного лучше, чем моя предыдущая лучшая и последняя попытка, и насколько ясновидящим просто и очевидно его использовать и настраивать. В нем есть только те ползунки, которые мне нужны, именно там, где я их жду, поэтому я могу сделать Magic Faster™.

Конечно, я также использую Perfectly Clear, так как пользуюсь уже довольно давно. Я пробовал HDR всего несколько раз. На этом раннем этапе я вижу, что Perfectly Clear предназначен для обычного использования, например, для семейных фотографий на рождественскую открытку и для всего остального.Я добавляю сумасшествие в Perfectly Clear, чтобы сойти с ума, в то время как я могу добавить простоту в HDR и легко сойти с ума. HDR позволяет легко довести мои не слишком сумасшедшие фотографии до безумного уровня цвета и воздействия.

 

04 декабря 2021, суббота

YUM: Giant Lindt 10,2 унции. Адвент-календарь немецкого производства.

Ты же знаешь, я большой ребенок. В детстве у нас были картонные адвент-календари с маленькими окошками в стиле «автомобильного бинго», чтобы каждый день показывать маленькую картинку чего-нибудь рождественского.Веселье заключалось в том, чтобы каждый день искать правильное окно.

Будучи большим ребенком, я перешел на немецкие адвент-календари, в которых было всего 1,7 унции (50 г) шоколада, что достаточно для крошечного вкуса каждый день.

В этом году мне удалось раздобыть один из этих колоссов Lindt, и это здорово! Каждый день у Lindt разные деликатесы, и в первый день я получил два угощения. Я люблю этот сезон!

 

03 декабря 2021, пятница

НОВИНКА: Сравнение лучших картридеров USB-C, док-станций и концентраторов.

Я потратил полтора дня на измерения, фотографирование и запись всего этого, чтобы сэкономить себе несколько секунд времени загрузки.

Удивительно, но загрузка одного и того же набора из 500 файлов объемом 5 ГБ может занять всего 12 секунд или более двух минут, в зависимости от того, что вы используете, и самое удивительное, что простое использование неправильного кабеля может иметь большое значение — даже с одной и той же картой. компьютер и читатель!

 

Устройство чтения Lexar CF, SD и Micro Card . больше.

 

ПОДСКАЗКА: Самым быстрым SD-ридером был Lexar CF, SD & Micro Card Reader, который я купил на Amazon за 29,99 долларов на прошлой неделе, и теперь он продается всего за 21,99 долларов в B&H.

 

02 декабря 2021, четверг

НОВИНКА: я добавил максимальные коэффициенты репродукции макросъемки для каждого из объективов Canon RF в моем индексе объективов Canon RF.

 

Скидка 50 долларов и НОВИНКА: Цифровой монокуляр Canon ZOOM: 269 долларов.99 !!!

Ух ты, вчера было 319,99 долларов, а сегодня 269,99 долларов . По этой цене он будет бесплатным к Рождеству, но это указано как специальное предложение Cyber ​​Week. Бери, пока можешь.

 

01 декабря 2021, среда

НОВИНКА: Sony Alpha Drone System

Этот БПЛА держит вашу камеру Sony Alpha или аналогичную!

Для него есть специальный стабилизатор, а вот ссылки на запасные зарядные устройства, аккумуляторы, пропеллеры и пульты дистанционного управления.

 

НОВИНКА: Цифровой монокуляр Canon ZOOM

Это крошечный (5 унций/145 г) стабилизированный электронный зум-прицел с 12-мегапиксельной камерой и просмотрщиком. Насколько я могу судить, это полноценная высококачественная система беззеркальных камер и просмотрщик с выделенным длиннофокусным зум-объективом. Вы можете просто просматривать его с помощью Live View или использовать его для видео и фотоснимков.

Похоже, это отличный подарок для наших друзей, которые хотят пойти с нами, но не носят с собой большой зум-объектив и камеру.Это должен быть отличный подарок для орнитологов, мам людей с кормушками для птиц или для ношения с моим iPhone 13 Pro Max, когда у меня нет другой камеры, поскольку она улавливает теледиапазон там, где iPhone останавливается.

Созданный Canon, мировым лидером в производстве камер и стабилизированной спортивной оптики, вы знаете, что он должен быть качественным.

За 319,99 долларов как можно ошибиться? Вы можете вернуть его до первого февраля следующего года из B&H, если он вам не ЛЮБИТ.

 

НОВИНКА: Рюкзак для цифровой зеркальной фотокамеры Tenba DNA 16

 

Скидка 100 долларов: Nikon Z 24-50 мм FX.
Скидка 30 долларов: Nikon DX 40mm f/2.8 Macro.

 

В наличии

Никон Z FC

Вы знаете, что хотите этого.

 

Мощный комбо DJI Action 2 Камера

или звонок в дверь?

 

Камера Vuze XR 3D VR180° / 2D 360° 5.7K

Самая забавно выглядящая камера! Попробуйте НЕ , чтобы посмеяться!

 

Сферическая камера Vuze 4K 3D 360 VR

Последняя камера выглядит как робот, а эта — как Roomba или Alexa!

 

НОВИНКА: McIntosh MQ 107 Экологический эквалайзер Обзор.

Я только что получил один и проверил его в своей лаборатории, поэтому я опубликовал этот лабораторный отчет.

Жестко, вот как этот веб-сайт начался более 22 лет назад: я публикую свои собственные лабораторные данные для личного ознакомления.

 

30 ноября 2021 г., вторник

Скидка 100 долларов: Комплект GoPro HERO7 Black: 249 долларов.
Скидка 1500 долларов: Canon 1D X Mark II: 4499 долларов.
Скидка 550 долларов: Canon 80D с 18-135 мм: 1149 долларов.
Скидка 200 долларов: Canon EOS R: 1599 долларов.

 

29 ноября 2021 г., Киберпонедельник

Новые предложения Киберпонедельника

Зона сделок Киберпонедельника B&H
Киберпонедельник Адорамы

 

Сони

Скидка 600 долларов: A7 III с 24–70 мм f/2,8: 3596 долларов.

Еще 21 предложение: Пакетные предложения A7 III.

 

яблоко

Скидка 220 $: 13.3-дюймовый MacBook Pro, Retina, середина 2020 г., цвет «серый космос»: 1079 долларов США.

Скидка 200 долл. США: 14,2-дюймовый MacBook Pro M1 Pro, конец 2021 г., цвет «серый космос»: 1799 долл. США.

Скидка 130 долл. США: 13,3-дюймовый MacBook Air M1, дисплей Retina, конец 2020 г., серебристый: 869 долл. США . Срок действия истекает в полночь по Нью-Йорку/21:00 по времени западного побережья, пока есть в наличии.

Скидка 170 долларов США: внешний жесткий диск Seagate емкостью 16 ТБ: 369 долларов США.99. Я использую четыре из них поочередно для резервного копирования всех своих компьютеров (я использую размер 10 ТБ).

 

и многое другое!

Скидка 240 долларов: штатив Oben CT-2491 из углеродного волокна и комплект шаровой головки BC-166: 408,50 долларов.

Еще 18 предложений: Oben Tripod Deals.

Скидка 150 долларов: Luxli Timpani 1×1 ‘LED RGBAW Light: 849,99 долларов. Я использую два из них для всего, что делаю на KenRockwell.TV.

Самая низкая цена: программное обеспечение Capture One.

Половина цены: наушники Sennheiser HD 25 Special Edition Pro: $99,99.

Это относится и к Киберпонедельнику в БиГ:

 

Предложения в изобилии в Adorama, Amazon, B&H и Crutchfield, и вот еще несколько страниц со специальными предложениями:

Предложения дня от Adorama  

Ежедневные предложения Amazon

Зона сделок B&H

Отдел продаж Crutchfield (подсказка: Crutchfield также специализируется на домашнем и автомобильном Hi-Fi-аудио и домашнем кинотеатре, так что купите себе что-нибудь вкусненькое!)

Распродажа сумок Think Tank.

 

Половина идеально чистая!

Perfectly Clear — это программное обеспечение, которое я использую для большинства своих снимков. Это заставляет их выглядеть лучше и быстрее, чем делать это вручную.

Perfectly Clear Complete автоматически применяет до 40 исправлений к каждому изображению. Perfectly Clear делает все — от цветокоррекции до ретуши — получите свою копию сегодня со скидкой 50 % по коду KEROCKWELL . Уже есть? Я договорился об эксклюзивном предложении для вас со скидкой 35% на все предустановленные пакеты с кодом KEN35 здесь.

 

28 ноября 2021 г., воскресенье

Так люблю Амазонку

Мы все видели, как средства массовой информации пытались напугать нас, беспокоясь о том, что наши покупки будут сорваны из-за длительных задержек, поэтому вчера вечером мне действительно пришлось посмеяться.

Я заказал тонну на Amazon в Черную пятницу, как я поделился ниже. Большую часть обещали доставить к предстоящему вторнику, 30-го числа.

Большая часть уже прибыла вчера — всего за один день!

Боже, благослови Амазонку! Я пишу это на своем MacBook Pro 2017 года, используя мои распродажные 47 долларов.99 Anker Side-Mount USB-C Hub, чтобы поставить мой MacBook на мой 55-дюймовый монитор 4K HDMI на моем столе. Ура!

Как и ожидалось, элегантный концентратор Anker Side-Mount USB-C UniDock рассчитан и работает только на частоте 4K/30 Гц; Я должен попробовать другие концентраторы, шнуры и адаптеры, чтобы увидеть, имеет ли значение что-то еще для 60 Гц. С этого хаба заявлено 4K/60, но только через USB-C. Разъемы USB-A выдают только 500 мА, а второй разъем USB-C выдает только 6,5 Вт — при слабых 4,3 вольта!

Еще одна хорошая новость: $17.99 концентраторов USB-C, которые я заказал, также кажутся очень красивыми, вырезанными из блоков твердого алюминия цвета космоса. Они отлично работают при разрешении 4K/30, а выход USB-A составляет не менее 1,5 А.

Похоже, что этот концентратор USB-C с косичкой за 24,99 доллара производится на том же заводе, что и концентраторы USB-C за 17,99 доллара. Разница в том, что этот концентратор за 24,99 доллара заменяет один из трех разъемов USB-A разъемом USB-C, который также принимает входную мощность PD. Если вы подключите питание к этому концентратору за 24, 99 долл. США, это будет просто сложнее, чем просто использовать концентратор USB-C бокового монтажа Anker за 47, 99 долл. США, но оставляет один разъем USB-C на компьютере, который имеет больше функций, чем второй разъем USB-C на Anker UniDock. .Этот концентратор за 24,99 доллара также выдает не менее 1,5 А от USB-A, и делает это даже без подключения к моему Mac с источником питания PD, подключенным к его боковой розетке. Как ни странно, я получаю только данные, а не заряжаюсь от боковых розеток USB-C при подключении к моему MacBook Pro.

Этот приятный металлический переходник USB-C на 4 USB-A цвета космоса за 15,99 долл. США также отлично работает со светодиодным индикатором питания (как и все остальные), а его четыре разъема USB-A имеют питание, но, похоже, ограничены традиционными 500 мА на каждом выходе. , набухать для внешних накопителей и ридеров или медленная зарядка, но не быстрая зарядка.Он также обеспечивает выходной ток 500 мА при подключении к разъему USB-C на док-станции Anker Side-Mount USB-C UniDock.

Этот концентратор Anker 8-в-1 стоимостью 64 доллара США (скидка 29%) поддерживает 4K/60 и отлично передает мощность PD, но это всего лишь пластик, а маркировка для данных USB-C и USB-C PD невидима. Этот, вероятно, восходит к прошлому; кто хочет втыкать пластик в MacBook Pro?

Этот пигтейл-концентратор Anker 6-в-1 (скидка 20%) имеет размер всего 4k/30 и также изготовлен из пластика, но обеспечивает сквозное питание PD. Вероятно, он возвращается; кто хочет втыкать пластик в MacBook Pro?

Концентратор Anker 7-в-1 (скидка 20 %) изготовлен из пластика 4K/30 и вдвое дешевле других концентраторов Anker.Он пропускает питание, и все они имеют устройства чтения SD-карт и светодиоды питания.

Святая корова: дети только что проверили, и пока я пишу это, Amazon только что принесла нам еще одну огромную кучу того, что мы заказали. Здесь нет глобальной катастрофы; мы готовы к Рождеству в ноябре, а не в феврале, как нас уверяют СМИ!

Я все еще жду, когда прибудут мой Lexar CF, SD & Micro Card Reader и Ritz Gear CFexpress Type B Reader, а затем я проведу несколько тестов скорости загрузки со всеми этими и SDXC-картами и посмотрю, что произойдет.

 

1960 LEICA SUMMICRON 90mm f/2.

Обновлено: LEICA SUMMICRON 90mm f/2 (1959-1980) .

Я случайно оказался на этой странице, поэтому обновил ее впервые за 11 лет.

 

Новинка на Кратчфилде: Nikon Z 28mm f/2.8 .

Сделки ниже все еще активны:

 

26 ноября 2021 г., Черная пятница

Я только что купил эти предложения для себя:

Половина цены: Anker Executive Power Bank: 109 долларов.99.

На самом деле, последние пару недель, когда я присматривался к нему, он стоил 219,99 долларов. Он обладает огромной мощностью 97 Втч (27 000 мАч) и имеет выход USB-C PD 45 Вт для запуска и зарядки ноутбуков, а также розетку переменного тока 110 В для питания чего-либо еще до 100 Вт.

 

Я только что получил MacBook Pro только с двумя портами USB-C (ThunderBolt 3), поэтому я заказал несколько концентраторов и картридеров на пробу, поскольку почти все в Amazon можно вернуть бесплатно до 31 января следующего года.В продаже сегодня:

Скидка 25%: Ritz Gear CFexpress Type B Reader: 29,99 долларов США.

Мне нужен считыватель CFexpress, но я был слишком дешев, чтобы купить его — до сегодняшнего дня. Мне нравится моя карта RitzGear CFexpress емкостью 256 ГБ, которую я до сих пор использовал только для резервного копирования в камере. Этот считыватель Ritz Gear CFexpress Type B оснащен разъемом USB-C и двумя шнурами для подключения к USB-C или USB-A.

 

Скидка 20%: Концентратор USB-C бокового монтажа Anker: 47,99 долларов США.

Вставляется сбоку MacBook Pro.Он имеет 2 выхода USB-C вместо тех, которые он закрывает, и добавляет устройства чтения карт SD и Micro, 2 порта USB-A и разъем HDMI (4K/30). Чтобы получить 4K/60, вам нужно использовать адаптер или кабель от одного из двух разъемов USB-C.

 

Я заказал два таких концентратора USB-C за 17,99 долларов. У меня на MacBook Pro два разъема USB-C, так почему бы и нет? У каждого из них есть штекер USB-C на пигтейле, а затем устройства чтения карт памяти SD и Micro, 3 разъема USB-A и разъем HDMI (4K/30). Мой опыт работы с безымянной электроникой от Amazon показывает, что они служат всего год и умирают.Посмотрим.

Я также заказал хороший кардридер Lexar CF, SD & Micro на тот случай, если будет разумнее путешествовать просто с хорошим картридером и правильным шнуром. Я заказал несколько шнуров USB-C на USB-3 для прямого подключения моих картридеров и резервного копирования жестких дисков.

Не заказан, потому что сегодня его нет в продаже, это устройство чтения карт CFexpress типа B и CF «ProGrade», так как оно стоит больше, чем хорошие устройства чтения Lexar и Ritz Gear вместе взятые.

Я также заказал по одной из этих концентраторов Anker 5-в-1, 6-в-1 (скидка 20%), 7-в-1 (скидка 20%) и 8-в-1 (скидка 29%), каждый с косичкой USB-C и различными разъемами.

Я также заказал этот красивый космический серый переходник USB-C на 4 USB-A.

Когда все это прибудет, мы увидим, что я на самом деле использую, и с бесплатным возвратом до 31 января следующего года я могу отправить обратно все, что мне не нравится или не нужно. Описания и фотографии Amazon никогда не показывают вещи во всех подробностях, которые я делаю в своих обзорах, и только Бог знает, насколько хорошо все это на самом деле работает для чтения нескольких карт и других устройств.

Конечно, если бы я был умным, вместо того, чтобы тратить время на покупку всего этого, я бы просто купил новый MacBook Pro, в котором есть слоты для карт памяти и HDMI, а также разъемы для зарядки MagSafe.Я бы не только сэкономил время на покупках, но и сэкономил бы время, не возясь со всем этим хламом в каждой поездке со своим старым MacBook Pro. PS: новые MacBook Pro могут заряжаться через MagSafe или заряжаться через USB-C со всеми источниками питания, которые я только что заказал. Черт возьми, когда я пишу это, мой старый MacBook Pro только что зарядился за полтора часа от солнечной панели мощностью 80 Вт и преобразователя постоянного тока в USB-PD!

Наконец-то для себя (а не для своего бизнеса) я заказал два дневных велосипедных задних фонаря американского производства со скидкой 28%, которую я хотел в течение многих лет.Они в три раза ярче, чем те, которыми я пользовался от той же фирмы. Фонари на 80-150 люмен, которые я использовал в течение многих лет, настолько яркие, что могут ослепить астронавтов в космосе, а люди в автомобилях перестали дополнять меня тем, что мой фонарь на 80 люмен был самым ярким задним фонарем, который они когда-либо видели. Я бы предпочел, чтобы меня не сбили, даже если автомобилистам нужно ответить на очень важные сообщения или они слишком заняты просмотром ЖК-экранов своих автомобилей, чтобы замечать велосипедистов. В режиме стробоскопа они привлекают внимание, казалось бы, за много миль — и это в дневное время.Даже я не настолько сумасшедший, чтобы кататься ночью.

 

25 ноября 2021 г., День благодарения

Я только что заказал две из этих электростанций Anker мощностью 300 Вт, которые сегодня продаются на Amazon по большой распродаже по 219,99 долларов США каждая; всю прошлую неделю и вчера они стоили 359,99 долларов.

Я также заказал одну из этих электростанций Anker мощностью 213 Втч за 169,99 долларов США; они стоили 229,99 долларов.

 

23 ноября 2021 г., Черная пятница грядет

Я только что заказал себе два премиальных аккумулятора на солнечных батареях Anker емкостью 20 000 мАч по цене 39 долларов.99.

У всех нас разные потребности, и, судя по тому, как этот был в продаже, он имеет огромную емкость, имеет выход USB-PD 18 Вт (идеально подходит для зарядки моих Canon и всего остального, что требует USB-PD для быстрой зарядки), и даже имеет встроенную солнечную панель, чтобы заряжать себя бесплатно, я не мог устоять. Кроме того, это Anker, а не безымянный мусорный бренд; Мне всегда везло с кабелями, зарядными устройствами и блоками питания Anker.

Я также обнаружил, что эта солнечная панель, сделанная в США, действительно выдает от 5 до 6 Вт, как заявлено.Он отлично справляется с зарядкой этого повербанка на 10 000 мАч каждый день, а затем я заряжаю свой iPhone 13 Pro Max от повербанка каждую ночь. Я продолжал этот эксперимент в течение недели, после чего объявил его успешным. Ваши результаты будут зависеть от того, сколько у вас солнца и как часто вы используете свой телефон, но вы поняли идею. (Не стесняйтесь выбрасывать дерьмовый блок питания, который идет в комплекте с панелью; используйте настоящий блок питания, и вы станете золотым.)

Солнечные батареи не всегда обеспечивают то, что заявлено, а блоки питания не всегда эффективно заряжаются от них.Эта комбинация солнечной панели и блока питания очень хорошо работает вместе, достаточно хорошо, чтобы бесконечно и удобно питать мой iPhone.

Несмотря на то, что солнечная батарея емкостью 20 000 мАч может заряжаться от встроенной панели, я предполагаю, что для полной зарядки потребуется пара недель. Вероятно, потребуется несколько дней от внешней панели 6 Вт.

Если вам нужна быстрая зарядка чего-либо непосредственно от солнечной батареи, вам потребуются панели гораздо большего размера, преобразователь постоянного тока в USB-PD и некоторые инженерные знания, или большая панель с выходом USB-PD, подобная этой, для зарядки блоков питания или Устройства iOS так же быстро, как они подключаются к сетевым адаптерам или блокам питания.Удачи; трудно найти панели высокой мощности, которые подключаются к USB-PD.

Хорошей новостью является то, что если вы можете оставить внешний аккумулятор и панель на зарядке на весь день, хороший внешний аккумулятор быстро зарядит ваши устройства ночью, и вам не придется оставлять iPad на солнце весь день. !

 

Никон

Скидка 500 долларов США: 24–70 мм f/2,8 VR и бесплатные материалы: 1 596,95 долларов США. Также продается в Кратчфилде.

Скидка 400 долларов США: Z5 с бесплатной картой памяти на 64 ГБ, сумкой, аккумулятором и другими вещами: 996 долларов США.95.

Скидка 400 долларов США: Z5 с 24–50 мм, картой памяти 32 ГБ, сумкой, штативом и другими аксессуарами: 1 296,95 долларов США.

Скидка 400 долларов США: Z5 с 24–200 мм, картой памяти на 64 ГБ, штативом и другими аксессуарами: 1 796,95 долларов США.

Скидка 300 долларов США: 200–500 мм f/5,6 VR и бесплатные вкусности: 1 096,95 долларов США. Также продается в Кратчфилде.

Скидка 300 долл. США: D850: 2 696,95 долларов США. Возможно, это лучшая камера, которую когда-либо выпускала компания Nikon. Также продается в Кратчфилде.

Скидка 300 долларов США: 500 мм f/5,6 VR: 3 296,95 долларов США. Также продается в Кратчфилде.

Скидка 300 долларов США: 16–35 мм f/4 VR с бесплатными вкусностями: 796,95 долларов США.

Скидка 70 долларов США: 18–300 мм DX VR и бесплатные вкусности: 626,95 долларов США.

Скидка 30 долларов США: Z 40 мм f/2: 266,95 долларов США.

 

Сони

Скидка 800 долларов США: A7R III (v2) с бесплатной вспышкой: 1998 долларов США. Также продается в Кратчфилде.

Скидка 500 долларов США: A7R IV (v2) с бесплатной вспышкой: 2998 долларов США.

Скидка 400 долларов США: FE 24–70 мм f/2,8 GM и бесплатные вкусности: 1 798 долларов США

Скидка 200 долларов США: A7 III и флеш-память бесплатно: 1798 долларов США.

Скидка 200 долларов США: A7 III с объективом FE 28–70 мм и бесплатной вспышкой: 1998 долларов США.

Скидка 150 долларов США: ZV-1 с комплектом Sony VLogger (Bluetooth, ручка, штатив, карта памяти на 64 ГБ и т. д.): 746 долларов США (также в белом цвете)

Скидка 150 долларов США: RX100 VA и бесплатные товары: 848 долларов США.

Скидка 100 долларов США: RX100 VII и бесплатные товары: 1198 долларов США.

Скидка 100 долларов США: RX10 IV и бесплатные товары: 1598 долларов США.

Скидка 100 долларов США: Sony APS-C 10–18 мм OSS и бесплатные вкусности – 798 долларов США.

Скидка 50 долл. США: FE 24 мм f/2.8 и бесплатные вкусности: 548 долларов.

 

19 ноября 2021, пятница

Canon RF 100–400 мм IS USM.

Обновление: Canon RF 100-400mm IS USM .

Мой был у меня пару недель, но я был так занят редактированием фотографий из Йосемити, сделанных в прошлом месяце, что не успел добавить деталей в свой обзор RF 100-400 мм.

Так как многие из вас любопытны, да, новый RF 100-400 одновременно и удивительно резкий, и вот самое безумное: его автофокус почти мгновенный!

По сравнению с моим любимым большим EF 100-400mm f/4.5-5.6L IS II, этот объектив RF 100-400 выглядит столь же впечатляюще резким и фокусируется так же быстро, а объектив RF на 90 233 меньше, чем половина веса 90 234 (635 г против 1550 г) и примерно на четверть 90 234 дешевле. (649 долларов против 2399 долларов).

Если вы не пропустите разницу в скорости в один стоп (я не пропущу), ДА! RF 100-400 — легкий победитель с металлическим креплением.

Более того, он есть в наличии в B&H и, я думаю, в Adorama, когда пишу это.

Я так рад, что снимаю на Canon.Беззеркальный Nikon 100-400 стоит 2697 долларов и весит 1435 г; у них нет соперника в легком весе. Canon дает мне больше возможностей для выбора.

Вот образец снимка с моего объектива RF 100-400mm IS USM вчера на рассвете:

Пальмы пустыни на рассвете, четверг, 18 ноября 2021 г., 6:35. Авто ISO 100 (LV 12¼), идеальная четкость. больше или исходный файл камеры 45MP © JPG.

Четкое изображение с широко открытой диафрагмой 45 МП, отличная стабилизация, невесомость и почти свобода. Я продан!

 

Пока мы здесь, я сделал это несколько часов назад при лунном свете, с рук, на свой новый RF 16mm f/2.8:

Moonlit Wall, Энсенада, Северная Нижняя Калифорния, Мексика, 19:14, четверг, 18 ноября 2021 г. 5 секунд при Auto ISO 3200, -0.Компенсация экспозиции 7 стопов (которая не понадобилась, LV 0,4), Perfectly Clear. файл большего размера, с полным разрешением или исходным файлом с разрешением 45 МП © JPG.

Белые точки — это звезды. Я никогда не мог сделать это с рук во времена кино. Никто другой не делает ультра-сверхширокий такой быстрый и такой маленький. Всего за 299 долларов это просто потрясающе: воплотить в жизнь мечту о беззеркальных камерах, как ни один другой бренд. Браво!!!

 

18 ноября 2021 г., четверг

Nikon Z 28 мм f/2.8.

НОВИНКА: Nikon Z 28 мм f/2,8 .

Это просто косметический вариант Z 28mm f/2.8 SE по той же цене.

 

Canon EF 28-80mm f/2.8-4 L ULTRASONIC .

НОВИНКА: Canon EF 28-80mm f/2.8-4 L ULTRASONIC Обзор и образцы изображений .

Первый экзотический зум среднего диапазона f/2.8 от Canon с автофокусом. Он отлично работает с новейшими беззеркальными камерами и продается всего за 325 долларов, если вы знаете, как выиграть на eBay.

 

17 ноября 2021 г., среда

Остерегайтесь Nikon FTZ II

Читатель написал, что Nikon каким-то образом улучшил FTZ II по сравнению с оригинальным FTZ. Неа; то же самое с более тонким корпусом без штативной лапки. Что наиболее важно, у обоих нет мотора автофокусировки, поэтому они не могут автофокусироваться ни с одним из традиционных объективов Nikon с винтовой фокусировкой AF и AF-D, многие из которых Nikon до сих пор продает новые.

Этот читатель был введен в заблуждение каким-то хитрым копирайтингом, который утверждал:

«Полная автофокусировка/автоэкспозиция поддерживается при использовании объективов FX или DX AF-S типа G/D/E, AF-P типа G/E, AF-I типа D и AF-S/AF-I. Телеконвертеры.»

Вам придется прочитать всю мою страницу о технологиях объективов Nikon, чтобы разобраться в алфавитном супе, однако трюк копирайтинга заключался в упоминании AF-D на одном дыхании с AF-I.

Как вы все знаете, AF-I был первой примитивной попыткой Nikon использовать моторы автофокусировки в объективе, и эти объективы частично выполняют автофокусировку с FTZ и FTZ II. Кроме того, как вы все знаете, все объективы Nikon, представленные с 1992 года, были AF-D. AF-D означает, что он связывает данные о расстоянии фокусировки с камерой для лучшего замера вспышки; это не относится к тому, как фокусируется объектив.

На английском языке AF-D — это просто дистанционная связь, а AF-I, AF-S и AF-P — технологии моторов автофокусировки, отсутствовавшие в первых объективах AF.

FTZ и FTZ II могут выполнять автофокусировку только с объективами со встроенными моторами, и это только примитивные объективы AF-I, распространенные сегодня объективы AF-S и новейшие объективы AF-P.

Извините. Этот бессмысленный алфавит системной несовместимости является одной из многих причин, по которым я перешел на Canon в марте 2012 года, выпустив 5D Mark III, в котором были устранены все недостатки 5D Mark II, в то время как Nikon почил на лаврах и до сих пор не устранил многие из моих проблем. концерны, которые были в их продуктах задолго до этого.Я правильно предсказал; Меня отметили, что конкуренты D800 и D800E, представленные за месяц до этого (февраль 2012 г.), не смогли решить то, чего не хватало в предыдущей модели D700, в то время как 5D Mark III продвинулась вперед — и Canon продолжает улучшаться, в то время как Nikon просто добавляет больше пикселей, но не на самом деле. представление. У D810 и D850 все еще есть эти дурацкие банки настроек, которые вместе контролируют только 2/3 того, что нам нужно, в то время как Canon добилась этого 15 или более лет назад с их простыми предустановками C1, C2 и C3, которые напоминают все .

Слава богу, у нас так много вариантов; у всех нас есть свои предпочтения. Все объективы Canon , выпускаемые с 1987 года, отлично автофокусируются при использовании любого из их преобразователей EF в RF, и еще больше сводит с ума то, что китайские адаптеры EF в Z позволяют старым объективам Canon работать и автофокусироваться лучше на Nikon Z, чем в большинстве собственных объективов Nikon с включенным Собственные FTZ и FTZ II от Nikon! Как также упоминалось в пресс-службе Nikon, FTZ и FTZ II автофокусируются только с 90 из примерно 360 различных моделей объективов, произведенных Nikon; только примерно один из четырех.

Почему это? Все просто: Canon ошеломила мир (и поразила своих пользователей) потрясающей полностью электронной системой объективов EOS с цифровым управлением в 1987 году, в то время как Nikon и все остальные упорно трудились с механическим управлением фокусом и диафрагмой. Таким образом, любой объектив Canon EF легко адаптировать к другим электронным креплениям для беззеркальных камер, в то время как большинству объективов Nikon требуется множество примитивных механических интерфейсов только для управления самыми простыми функциями.

 

Обновлено: Nikon D3500 .

Я обновил цену и наличие. Это кричащая сделка и включает в себя отличный объектив. Это самая легкая цифровая зеркальная камера в мире, и она легче любой полнокадровой беззеркальной камеры.

 

11 ноября 2021, День ветеранов

НОВИНКА: Входная капсула Zoom EXH-8 Quad XLR для рекордера H8.

НОВИНКА: Микрофонный капсюль Zoom VRH-8 Ambisonic для рекордера H8.

НОВИНКА: Микрофонный капсюль Zoom XAH-8 X/Y-AB для рекордера H8.

НОВИНКА: 3-осевой ручной карданный стабилизатор Zhiyun-Tech CRANE-M3.

 

08 ноября 2021, понедельник

Сейчас в Кратчфилде: Nikon Z 24-120mm f/4. Также в Adorama и в B&H.
Сейчас в Кратчфилде: Nikon Z 100–400 мм f/4,5–5,6 VR. Также в Adorama и в B&H.

Очевидно, мои заказаны вместе с моим Z9, и когда прибудут мои настоящие, оплаченные версии для доставки, когда мы все их получим, я дам вам знать, что я думаю.Сейчас есть только те, кто получил их от Nikon в качестве услуги, так что эти мнения не совсем объективны.

 

Скидка 300 долларов: Sony 70-200/2.8 GM OSS (старая модель): 2298 долларов. (значительно улучшенная версия -II).

 

05 ноября 2021, пятница

Canon 5DS и 50 мм f/1,2 л.

СКИДКА 2400 долл. США и В НАЛИЧИИ: 50-мегапиксельная камера Canon 5DS/R: всего 1499 долл. США!!!

Я люблю свою 5DS/R и снимаю на нее все время.Сегодня это сделка века по цене 1499 долларов за большее разрешение, чем у любой другой камеры Nikon или Canon.

На самом деле, я только что добавил несколько новых примечаний в Руководство пользователя Canon 5DS и 5DS/R.

Для вас, поклонников, вы можете заметить, что моя 5DS/R — это камера, которую я так люблю, что просто не могу отложить ее, чтобы сделать студийные снимки. В отличие от любого другого оборудования на моем веб-сайте, где у меня есть студийный снимок камеры, у меня было время сделать это только сидя на крыльце! В противном случае он используется все время.

Я заплатил полные 3900 долларов за свой, когда он вышел. Теперь, когда вы можете получить то же самое, только новее, за 1499 долларов при распродаже, дерзайте. Он не только имеет большее разрешение, чем любой другой Canon или Nikon, он также оснащен задним ЖК-дисплеем с антибликовым покрытием и автоматической регулировкой яркости, которой, к сожалению, не хватает в большинстве других камер, поэтому он всегда выглядит великолепно при любом освещении. Получите свое, пока еще можете.

 

Сейчас в Кратчфилде: Nikon FTZ-II.

 

03 ноября 2021, среда

Предложения

Скидка 1500 долларов: Canon 1DX Mk II: 4499 долларов.обзор.
Скидка 300 долларов: Nikon Z7: 2496,95 долларов. обзор.
Скидка 159 долларов США: твердотельный накопитель WD USB-C емкостью 2 ТБ: 229,99 долларов США.
Скидка 50 долларов: Canon EF-M 22 мм f/2 STM: 199 долларов. обзор.
Скидка 20 долларов: Canon EF-s 24mm f/2.8 STM: 199 долларов. обзор.

 

В наличии: комплект DJI Action 2 с двумя экранами.
В наличии: Sigma APS-C 18-50mm f/2.8 для LEICA L.

 

02 ноября 2021, вторник

Предложения

Скидка 300 долларов США
STEAL : Полнокадровый объектив Canon EF 17–40 мм f/4 L: 499 долларов США.

Полнокадровый сверхширокоугольный объектив L менее чем за 500 долларов? Я заплатил намного больше за мой! Отлично работает на беззеркальных камерах с адаптером EF-RF. Мой обзор 17-40 мм.

Скидка 150 долларов: Canon EF-s 10-22 мм USM: 499 долларов.
Скидка 50 долларов: Nikon Z 50/2.8 Macro: 596,95 долларов.
Скидка 50 долларов: Sony RX 0 II: 848 долларов.
Скидка 100 долларов: Sony RX100 Mk VII: 1198 долларов.

 

01 ноября 1954 г.

Представление Kodak Tri-X

Сегодня, в 1954 году, Kodak представила Tri-X, светосильную черно-белую пленку с зернистостью.

Какое идеальное время; друг из Photogenic Supply в Филадельфии (также известный как Tog Tees) только что прислал мне один из своих стаканов для пинты американского производства с настоящей пустой канистрой из 35-мм Tri-X, встроенной в него:

В коробке я нашел бумажную подставку, как показано на рисунке.

Они также поставляются в наборах, и вы можете приобрести различные коробки для пленки. Как и всякая стеклянная посуда, мыть только вручную.

Ничто не мешает американским инновациям.

 

НОВИНКА: Nikon Z9 на Кратчфилде.

 

Что нового в:

октябрь 2021 г. : Nikon Z9, Nikon Z 18–140 мм VR DX, Nikon Z 24–120 мм f/4, Nikon Z 100–400 мм f/4,5–5,6 VR, Nikon FTZ II, Canon STEREOSCOPIC RF 5.2mm f/2.8L 190º Fisheye, обзор Canon RF 14-35mm f/4L IS USM, обзор Canon EF 135mm f/2.8 Soft Focus, Sony A7 IV, Sony FE 70-200mm f/2.8 GM OSS II, Apple Watch Series 7.

июль ~ сентябрь 2021 г. : Обзор Nikon Z fc, руководство пользователя Nikon Z7 II, Nikon Z FX 28mm f/2.8 Special Edition, Nikon Z 40mm f/2, Nikon Z 50mm f/2.8 Macro Review, Nikon Z 105mm f/2.8 VR Macro Review, Canon EOS R3, Canon RF 16mm f/2.8 STM, Canon RF 100mm f/2.8L IS USM Macro Review, Canon RF 100~400 мм IS USM, стереомикрофон Canon DM-E1D, передатчик Canon ST-E10 Speedlite, адаптер передатчика данных Canon AD-P1 для Android, переходник Canon AD-E1 от обычного к многофункциональному башмаку, Sony ZV- E10, Обзор Sony FE 14mm f/1.8 GM, Обзор Sony FE 24mm f/2.8, Обзор Sony FE 40mm f/2.5, Обзор Sony FE 50mm f/2.5, Обзор Sony FE 50mm f/1.2 Обзор GM, Fuji GFX 50S II, Fuji GF 35–70 мм, Fuji GFX 50S II с 35–70 мм, Fuji X-T30 II, Fuji XF 23 мм f/1,4, Fuji XF 33 мм f/1,4, Sigma 24 мм f/2 DG DN, Sigma 90mm f/2.8 DG DN полнокадровый для LEICA L, Sigma 150-600mm f/5-6.3 для Sony и для LEICA L, Tamron 18-300mm для Sony APS-C и для Fuji, Tamron 35~150mm f/2~2.8 для Sony, обзор Laowa Argus 35mm f/0.95, литий-ионная вспышка Godox Ving V860III TTL, адаптер Megadap Sony для объектива Nikon Z, обзор TTArtisan 35mm f/1.4 ASPH, Voigtländer Heliar Classic 50mm f/1.5. Полный обзор планарно-магнитных наушников Audeze LCD-XC.

Апрель — июнь 2021 г. :  Фотографии с центрального побережья Калифорнии, Canon EOS R3, обзор Canon EF 70-200mm f/2.8L IS USM III, Canon RF 100mm f/2.8L IS USM Macro, Canon EF 100mm f/ Обзор 2.8 Macro, сравнение всех объективов Canon 100 мм, Canon RF 400 мм f/2.8L IS, Canon RF 600 мм f/4L IS, обзор Nikon Z7 II, обзор Nikon Z fc, обзор Nikon Z 14-24 мм f/2.8, обзор Nikon Z FX 28 мм f/2.8 Special Edition, Nikon Z 50mm f/2.8 Macro, Nikon Z 50mm f/1.2 Обзор, Nikon Z 58mm f/0.95 Noct Review, Nikon Z 105mm f/2.8 VR Macro, Sony A1 Review, Sony A6100 Review, Sony E 16-55mm f/2.8 G Review, Sony FE 14mm f/1.8 GM Review, Sony Обзор FE 35mm f/1.4 GM, Обзор Sony E 70-350mm G OSS, Обзор Fujifilm X-E4, Обзор Fuji X-S10, Обзор Fuji XF 10-24mm f/4 R OIS WR, Fuji XF 18mm f/1.4R LM WR, Fuji XF 27mm f/2.8 R WR Review, Fuji XF 70-300mm R LM OIS WR Review, LEICA M10-R в черной краске , Pentax K-3 Mk III, iRig Pre 2 XLR Mic to Беззеркальная камера, DSLR, Предусилитель для iOS, телефона или компьютера, обзор шаровой головки Robus RTH-1050 емкостью 55 фунтов, карта Ritz Gear CFexpress на 256 ГБ, обзор электрического велосипеда Turboant Thunder T1.

Январь – март 2021 г. : Обзор Canon RF 50mm f/1.8 STM, обзор Canon RF 70-200mm f/4L IS, обзор Canon RF 85mm f/2 MACRO IS STM, обзор вспышки Canon EL-1, Nikon Z9 обзор, обзор SONY A1, обзор Sony A7C, обзор Sony FE 28-60 мм, Sony FE 24 мм f/2,8 G, Sony FE 40 мм f/2,5 G и Sony FE 50 мм f/2,5 G, Sony FE 35 мм f/1,4 GM, Sony Обзор FE 50mm f/1.2 GM, обзор и руководство по iPhone 12 Pro Max, обзор и руководство по Apple Watch Series 6, LEICA APO-SUMMICRON-M 35mm f/2 ASPH, LEICA 50mm f/1.2 NOCTILUX-M ASPH, Fuji GFX 100S, Fuji GF 80 мм f/1,7 R WR, Fuji X-E4, Fuji XF 27 мм f/2,8 R WR, Fuji 70–300 мм f/4–5,6 R LM OIS WR, Ritz 256GB 265 /120 МБ/с V60 SD-карта, обзор Mitakon 50mm f/0.95, обзор 7Artisans 50mm f/1.05, микронаправленный микрофон Polsen MVP-3, направленный микрофон Polsen MVP-6, петличный микрофон Polsen MO-CPL2 USB-C, Polsen SCL -1080 Двухнаправленный микрофон-пушка

Октябрь – декабрь 2020 г. : Обзор Canon 1DX Mark III, Canon RF 50mm f/1.8 STM Review, Canon RF 70-200mm f/4 L IS USM Review, Canon EOS M50 Mk II, большая вспышка EL-1 и необычный компактный PowerShot Zoom 100-400mm P&S, Canon PIXMA Pro-200, Nikon Z5 Review, Nikon Z6 Обзор II, Обзор Nikon Z7 II, Обзор Nikon Z 20mm f/1.8, Обзор Nikon Z 24-50mm, Обзор Nikon Z 24-200mm, Обзор Nikon Z 70-200mm f/2.8, Обзор Fuji 50mm f/1.0, Fuji X- S10, Fuji 10-24mm f/4 OIS WR R, LEICA Q2 Monochrom, LEICA SL-2 S, ZEISS ZX1, обзор наушников Audeze LCD-X, обзор TTArtisan 50mm f/1.4 ASPH, Sigma 105mm f/2.8 Макрос для Sony E или LEICA, Обзор адаптера автофокусировки Megadap Any Lens to Nikon Z, Обзор компактного штатива Oben CTT-1000L, Обзор чехла MacCase для iPad Pro.

Май — сентябрь 2020 г.: Сравнение Canon EOS R5, Canon EOS R6, Canon EOS R, RP, R5 и R6, Canon RF 15–35 мм f/2,8L, Canon RF 24–70 мм f/2,8L IS, Canon RF 24–105 мм IS STM, Canon RF 24–240 мм, Canon RF 70–200 мм f/2,8 L IS, Canon RF 85 мм f/1,2 L USM, Canon RF 85 мм f/1,2 L DS USM, Canon RF 85 мм f/1,2 L по сравнению с f/1.2L DS, Canon RF 85 мм f/2 Macro IS STM, Canon RF 100–500 мм, Canon RF 600 мм IS STM, Canon RF 800 мм IS STM, Canon RF 1.4-кратный удлинитель, Canon RF 2-кратный удлинитель, Canon 90D, Canon Rebel T8i (EOS 850D), Nikon Z5, Nikon Z 14-24 мм f/2,8, Nikon Z 24-50 мм, Nikon Z 50 мм f/1,2, Nikon Z TC- Телеконвертер 1,4×, телеконвертер Nikon Z TC-2×, Sony A7c, Sony A9 II, Sony A7S III, Sony FE 12-24 мм f/2,8 GM, адаптер Sony LA-EA5, Apple Watch Series 6, Fuji X-T4, Fuji X-T200, Fuji XC 35mm f/2, Fuji XF 50mm f/1.0, LEICA M10-R, LEICA Q2, Руководство пользователя LEICA Q2, LEICA Q2, Fuji X100F, iPhone 11 Pro Max, Canon 90D, LEICA, iPhone и Fuji по сравнению с Canon, LEICA SF-24D, Hasselblad 907X 50C, ZEISS SONNAR 50mm f/1.5, Tokina Opera 50mm f/1.4, Luxli Timpani, Cello and Viola 2 , Наушники Audeze LCD-1.

Апрель 2020 г.: Обзор Fuji XF 16-80mm f/4, Canon RF 24-105mm f/4-7.1 STM, Canon C300 Mk III, Canon 25-250mm T2.95 Cine, Olympus OM-D E-M5 Mk III, полнокадровый Irix, ручная фокусировка 45 мм f/1,4, Laowa 210º 4 мм f/2,8 Fisheye, Lensbaby Velvet 28 мм f/2,5, Rokinon AF 75 мм f/1,8, Tamron 70-180 мм f/2,8 для Sony, DJI Mavic Air 2 , DJI Mavic 2 Pro 4K, BlackMagic Pocket Cinema 6K, обзор рекордера Zoom H6.

Январь – март 2020 г. : Фотопродукты десятилетия 1820~2020, Nikon D6, Nikon D780, Nikon D780 Руководство пользователя на простом английском языке, Nikon 120-300mm f/2.8 FL VR, Nikon Z 20mm f/1.8, Nikon Z 24–200 мм, Nikon Z 70–200 мм f/2,8 VR, Nikon Coolpix P950, Canon 1DX Mark III, Canon Rebel T8i, Canon EOS-R5, Canon RF 100–500 мм f/4,5–7,1L IS USM, Canon RF 24-105 f/4~7.1 IS STM, карманный портативный принтер Canon QX10, обзор и руководство пользователя Sony A7R IV, Sony FE 20mm f/1.8, Sony E 50mm f/1.8 OSS, Sony E 55-210mm OSS, Fuji X100V, Руководство пользователя Fuji X100V на английском языке, Fuji X-T4, Fuji X-T200, Fuji XC 35mm f/2, Fuji GF 45-100mm f/4 OIS, LEICA M10 Monochrom, LEICA SUMMILUX-M 35mm f/1.4 ASPH Edition «LEITZ Wetzlar, LEICA S3, Tokina 85mm f/1.8 для полного кадра Sony, Laowa 65mm f/2.8 2× Ultra-Macro, Think Tank Рюкзак Retrospective 15, адаптер Fringer Canon EF -> Fuji X, адаптер Fringer Canon EF -> Nikon Z, DJI Mavic 2 Zoom со смарт-контроллером, обзор Senal SMH-1200.

Ноябрь и декабрь 2019 г. : Осенний цвет из Йосемити и Восточной Сьерры Калифорнии, Полный обзор Nikon Z50, Руководство пользователя на простом английском языке Nikon Z50, Обзор Nikon Z DX 16–50 мм VR, Обзор Nikon Z DX 50–250 мм VR, Обзор Nikon Z 85mm f/1.8, Обзор Nikon Z 24mm f/1.8, Обзор Sony A6600, Руководство пользователя Sony A6600, Беззеркальная камера Canon EOS Ra Astro, Обзор Fujifilm X-Pro3, Обзор Fuji GFX 100, Обзор Fuji GF 50mm f/3.5, Обзор Apple Watch Series 5, 32-дюймовый дисплей Apple Pro 6K, 32-дюймовый дисплей Apple Pro 6K с нанотекстурированным стеклом, обзор программного обеспечения Photo Mechanic, Tokina 100mm f/2.8 Полный кадр для Canon EF, LEICA SL2, Sigma 24-70/2.8 для Sony, Sigma 24-70/2.8 для LEICA L, обзор Turboant X7.

Август – октябрь 2019 г. : iPhone 11 Pro Max, Canon RF 15–35 мм f/2,8, Canon RF 24–70 мм f/2,8, Canon RF 85 мм f/1,2 L USM DS, Canon RF 70–200 мм f/ 2,8 л IS USM, Canon EOS 1DX Mark III, Canon 90D, Canon EOS-M200, Canon M6 Mk II, Fuji X-Pro3, обзор Fuji X-E3, Fuji X-A7, обзор Fuji XC 15-45mm PZ OIS, Fuji Обзор XC 50-230mm OIS, настройки сенсорного экрана Fuji, обзор Nikon D3500, Nikon Z 24mm f/1.8 S Review, Nikon Z 85mm f/1.8 Review, Nikon Noct-NIKKOR Z 58mm f/0.95, Nikon Z50, Nikon Z 16-50mm DX VR, Nikon Z 50-250mm DX VR, Nikon 200mm f/2 VR II Review, Panasonic S1H, Panasonic 24-70 мм f/2,8, Pansonic LEICA DG 25 мм f/1,4 II, Rokinon AF 18 мм f/2,8, Sigma fp с объективом 45 мм, Sony A9 II, Tamron 20 мм f/2,8, Tamron 24 мм f/2,8, Tamron 35mm f/2.8, Voigtländer Nokton 75mm f/1.5, обзор телескопической настольной микрофонной стойки Auray TT-6220, обзор микрофонного поп-фильтра Auray PFNY-6, обзор микрофона Senal SCM-660, обзор адаптера для штатива XUMA MTA-300B для iPhone/смартфона.

Июль 2019 г.: Rockwell.TV на YouTube, Обзор Nikon Z 24-70mm f/2.8, Обзор Nikon Z 35mm f/1.8, Обзор Nikon Z 50mm f/1.8, Canon RF 24~240mm IS, Sony A7R Mark IV, Sony RX100 Mark VII, обзор Sony FE 35mm f/1.8, LEICA ME typ 240, Hasselblad 907X Special Edition, Fujifilm XF 16-80mm f/4 R OIS WR, Fujifilm GF 50mm f/3.5 R LM WR, штатив ROBUS RC-5570 Обзор, Sigma 14-24mm f/2.8 для Sony E и LEICA L, Sigma 35mm f/1.2 для Sony E и LEICA L, Sigma 45mm f/2.8 для Sony Eund для LEICA L, беззеркальная камера Sigma fp.

Апрель – июнь 2019 г. : Обзор Nikon Z6, Руководство пользователя Nikon Z6, Руководство пользователя Nikon Z7, Обзор Nikon Z 14-30mm, Обзор Nikon NIKKOR 135mm f/2 AI-s, Обзор Nikon NIKKOR 180mm f/2.8 AI , Обзор Nikon NIKKOR✱ED 180mm f/2.8 AI-s, Обзор Nikon NIKKOR✱ED 200mm f/2 AI-s, Обзор Zeiss Otus 100mm f/1.4, Обзор Sony E 20mm f/2.8, Обзор Sony E 30mm f/3.5 Macro Обзор, Обзор Sony E 35mm f/1.8 OSS, Обзор Sony FE 135mm f/1.8 GM, Обзор Sony 200-600mm G OSS, Обзор Sony 600mm f/4 GM OSS, Tokina FiRIN 100mm f/2.8 Macro для Sony E, Voigtlander 21mm f/1.4 для Sony Full-Frame, Tamron 17-28mm f/2.8 full-frame ultrawide для Sony E, Canon RF 85mm f/1.2L USM, Rokinon 14mm f/2.8 для Canon RF, Rokinon 85mm f/1.4 для Canon RF, Canon SL3 (EOS 250D), Fujifilm X-h2 Review, Fujifilm X-T30 Review, Fujifilm X-T20 Review, Fujifilm 8-16mm f/2.8 Review, Fujifilm 16mm f/2.8 Review, Обзор Fujifilm GFX 100, Обзор Fujifilm GF 32~64mm f/4 R LM WR, Обзор Fujifilm GF 100~200mm f/5.6 R LM OIS WR, Сравнение качества изображения среднего формата и полнокадрового изображения, Обзор Apple iPhone Xs Max & Руководство пользователя, Обзор Apple Watch Series 4, Сравнение всех Apple Watch, новый 13-дюймовый MacBook Pro, новый 15-дюймовый MacBook Pro, подводная камера Olympus TG-6, Panasonic LEICA VARIO-SUMMILUX 10-25mm f/1.7, телеконвертер Panasonic DMW-STC14 1,4×, телеконвертер Panasonic DMW-STC20 2×, Think Tank «Digital Holster 150» для ультрателе, обзор мини-штатива Oben CTT-1000.

Март 2019 : Обзор Nikon Z7, Обзор Nikon Coolpix A1000, Nikon Coolpix B600, Обзор Sony E 16mm f/2.8, Обзор Sony E 18-200mm OSS PZ, Обзор Sony E 18-200mm OSS LE, Sony RX0 II, Камера мгновенной печати Canon IVY CLIQ, Камера мгновенной печати Canon IVY CLIQ+, Обзор Fujinon XF 80mm f/2.8 Macro OIS, LEICA Q2, LEICA APO-SUMMICRON-SL 35mm f/2 ASPH, Обзор вспышки Pixel X900, Полнокадровая ультра-ультра-камера Rokinon широкий 10мм f/3.5 для Canon EF, Rokinon 14mm f/2.8 Ultra-Ultrawide для Canon RF, Rokinon 85mm f/1.4 для Canon RF.

Февраль 2019 г.: Nikon Z 24-70mm f/2.8 S, практический обзор Canon EOS RP, руководство пользователя Canon EOS RP, сравнение Canon EOS RP и EOS R, обзор Canon RF 35mm f/1.8 Macro IS STM, Canon RF 28-70mm f/2L USM Review, Canon RF 85mm f/1.2L USM DS, Canon RF 85mm f/1.2L USM, Canon RF 24-240mm IS USM, Canon RF 70-200mm f/2.8L IS USM, Canon RF 24–70 мм f/2,8L IS USM, Canon RF 15–35 мм f/2,8L IS USM, Sony FE 135 мм f/1.8 GM, Fujifilm X-T3 Review, Fujifilm 23mm f/2 Review, Fujifilm 200mm f/2 Review, Fujifilm 50mm f/2 Review, Fujifilm XF 16mm f/2.8 WR, Fujifilm X-T30, Полнокадровая система Panasonic S1, Камеры Polaroid POP, Ricoh GR III, Ricoh WG-6 под водой, Ricoh WG-6 в оранжевом цвете, Ricoh G-900, Tokina Opera 16-28mm f/2.8, Tamron 35-150mm, Tamron 35mm f/1.4.

Январь 2019 г. : LEICA M10-P Safari Edition, LEICA SUMMICRON-M 50mm f/2 Safari Edition, обзор магнитно-планарных наушников Verum 1, Olympus OM-D E-M1 X, Nikon Z 24-70mm f/4 Обзор S, обзор Sony 10-18 мм, обзор Sony A6400, обзор Sony 18-135 мм, обзор Sigma 28 мм f/1.4 ART, Nikon Z 14-30mm f/4 S и Irix 150mm f/2.8 Macro обзор.

Ноябрь и декабрь 2018 г. :  Обзор 18-мм объектива Moment, Фотографии из Йосемити и Восточной Сьерры, Обзор Nikon 500mm f/5.6 PF, Адаптированные объективы дальномера на беззеркальных камерах Nikon, Обзор ховерборда AlienBoard, LEICA D-Lux 7, Зачем вам нужно Apple Watch, обзор Sigma 60-600 мм.

Октябрь 2018 г. : Множество откровений о беззеркальных камерах Canon и Nikon, первые китайские адаптеры Nikon Z, обзор Canon EOS R, руководство пользователя Canon EOS R, обзор штативной головки Wimberley Gimbal, Sony 400mm f/2.8 Обзор, Как фотографировать авиашоу, LEICA M10-D.

Август и сентябрь 2018 г. :   Nikon против Canon против Sony Full Frame , Беззеркальные против DSLR , Вам действительно нужны два слота для карт памяти, Обзор Canon EOS-R , Адаптеры для объективов Canon EF to RF, Canon Обзор RF 24-105mm, Canon RF 28-70mm f/2 L, обзор Canon RF 50mm f/1.2, обзор Canon RF 35mm f/1.8 MACRO IS STM, обзор Canon 70-200mm f/4L IS II, Canon EF400mm f/2.8 L IS III, Canon EF 600 мм f/4L IS II USM, Canon EF-M 32 мм f/1.4 STM. , Nikon Z6 и Z7, адаптер объектива Nikon FTZ, Nikon Z 24-70 мм f/4, Nikon Z 35 мм f/1,8, Nikon Z 50 мм f/1,8, Nikon 500 мм f/5,6 PF, Nikon D3500, LEICA M10-P , iPhone Xs Max Bokeh в сравнении с полнокадровыми профессиональными камерами, Tokina Opera 50mm f/1.4, Tamron 15-30mm f/2.8 G2, Fuji XT-3.

Июнь и июль 2018 г. : Беззеркальные камеры Nikon, Fuji 8-16 мм f/2.8, Fuji 200 мм f/2, Fuji XF10, Sony RX100VA, Nikon P1000, обзор Tamron 100–400 мм, лучшие 80–400 и 100 Сравнение зумов -400 мм, Как выиграть фотоконкурсы, Обзор Tamron 18–400 мм, Sony 400 мм f/2.8, Изображения Йосемити весной, Обзор Kodak Medalist II, Canon 70‑200 мм f/4L IS II, Canon 70‑200 мм f/ 2.8 L IS III и мой обзор Sony RX100 Mark VI.

Май 2018 г. : Секреты создания потрясающих фотографий Марка Зильбера, Sigma 105mm f/1.4, Fuji X-T100, Tamron 15-30mm f/2.8 IS/VR Review, beyerdynamic Amiron Home Review, Sigma 70mm Full-Frame Macro Art Lens, Nikon D1 High ISO Samples, Vello MB-D18 (BG-N19) Grip Review , Обзор Sunpak RD2000, Сравнение малых вспышек.

Апрель 2018 г. : Irix 11mm f/4 Review, Tamron 28-75mm f/2.8, Canon 85mm f/1.4 L IS Review, Tamron 70-200mm f/2.8 VR/IS Review, Best 70-200mm f/ Сравнение объективов 2.8, обзор Tamron 24-70mm f/2.8 VR/IS, сравнение лучших объективов 24-105 мм, рюкзак MindShift 18L, карманная кинокамера Blackmagic 4K, Fuji GF 250mm f/4, Fuji GF 1.Телеконвертер 4X TC WR, макроудлинитель Fuji MCEX-45G WR, макроудлинитель Fuji MCEX-18G WR, обзор Sony RX10 Mk IV, руководство пользователя Sony RX10 Mk IV, обзор beyerdynamic Aventho Wireless.

Март 2018 г. : Обзор Nikon 70-300mm AFP E FX, Обзор Nikon 28mm f/1.4 E FX, Обзор Nikon 10-20mm, Обзор Nikon D7500.

Февраль 2018 г. : Sony A7 III, Yosemite Photos, обзор Nikon 50mm f/1.8 Pancake-NIKKOR, обзор beyerdynamic DT1350, обзор beyerdynamic DT240, обзор Canon SL2.

Январь 2018 г. : Nikon 180-400 мм, обзор Canon 6D Mk II, обзор Canon 18-135 мм USM, Fuji X-A5, Sony 18-135 мм.

Декабрь 2017 г. : Обзор Canon 35mm f/2.8 Macro, обзор Sony A7R III, руководство пользователя Sony A7R III, обзор Sony FE 24-105mm f/4 G OSS, обзор Sony FE 100mm STF G OSS.

Ноябрь 2017 г. : Sony 50/2.8 Macro Review, Sony 90/2.8 Macro Review, LEICA CL, Sony 70-300mm G Review, Panasonic G9, iPhone X Review, How to Make Time Exposures with iPhone, 1X Photo Contest, Tamron 100-400мм.

Октябрь 2017 г. : Обзор Nikon D850, руководство пользователя Nikon D850, обзор Sony A7R III, Sony 24-105mm G, Sony 85/1.8, Canon G1X Mk III.

Июнь, июль, август и сентябрь 2017 г. : Canon 6D Mk II, Canon SL-2, Canon 85/1.4L, Canon TS-E 50/2.8, 90/2.8 и 135/4, Nikon D850, Nikon 70-300 VR DX AF-P, Nikon 28/1.4E, Metabones Mk V Canon EF -> переходник Sony E-mount.

Май 2017 г. : Nikon 10-20mm DX VR, Nikon 8-15mm FX Fisheye, обзор Canon 77D, обзор Canon Rebel T7i, обзор Canon 18-55mm IS STM, Springtime in Yosemite, Irix 15mm f/2.4, обзор Sony 16-35/2.8 GM, Sony 12-24/4 G, обзор Fuji X100F, обзор Laowa 12 мм, Olympus TG-5.

Март и апрель 2017 г. : Nikon D7500, обзор Nikon 19 мм PC-E, обзор Nikon D3400, обзор Sony A7 Mk II, обзор Nikon D5600.

Февраль 2017 г. : Canon 77D, Canon Rebel T7i, Canon EOS M6, Sony 24-70/2.8 GM, Sony 85 мм f/1.4 GM, Sony 70-200 мм f/4 G OSS, Sony FE 100 мм f/2.8 STF GM OSS, Sony FE 85 мм f/1.8.

Январь 2017 г. : LEICA M10, Fujifilm GFX 50S, Fujifilm X100F, Nikon D5600.

Ноябрь и декабрь 2016 г. : Fuji X-A10.

Сентябрь и октябрь 2016 г. : Nikon 70-200mm f/2.8 FL, Nikon 19mm PC-E, Sony A6500, Sony RX100 Mk V, Sony Alpha 99 II, Canon EOS M5, Canon EF 70-300 IS II USM, Sony 50мм f/2.8 Макро.

Июль и август 2016 г. : Canon 5D Mk IV, 16-35 IS II, 24-105 IS II, Nikon D3400, Nikon 105mm f/1.4, Fuji XT-2.

июнь 2016 г.

Апрель и май 2016 г.

Март 2016 г.

Февраль 2016 г.

Январь 2016 г.

Декабрь 2015 г.

Ноябрь 2015 г.

октябрь 2015 г.

Сентябрь 2015 г.

август 2015 г.

июль 2015 г.

июнь 2015 г.

Май 2015 г.

Апрель 2015 г.

Март 2015 г.

Февраль 2015 г.

Январь 2015 г.

Декабрь 2014 г.

Ноябрь 2014 г.

Сентябрь и октябрь 2014 г.

Июль и август 2014 г.

июнь 2014 г.

Апрель и май 2014 г.

Март 2014 г.

Январь и февраль 2014 г.

Декабрь 2013 г.

Ноябрь 2013 г.

октябрь 2013 г.

Сентябрь 2013 г.

август 2013 г.

июль 2013 г.

июнь 2013 г.

Май 2013 г.

Апрель 2013 г.

Март 2013 г.

Февраль 2013 г.

Январь 2013 г.

Декабрь 2012 г.

Ноябрь 2012 г.

Октябрь 2012 г.

Сентябрь 2012 г.

август 2012 г.

июль 2012 г.

июнь 2012 г.

Май 2012 г.

Апрель 2012 г.

Март 2012 г.

Февраль 2012 г.

Январь 2012 г.

Декабрь 2011 г.

Ноябрь 2011 г.

октябрь 2011 г.

Сентябрь 2011 г.

август 2011 г.

июль 2011 г.

июнь 2011 г.

Май 2011 г.

Апрель 2011 г.

Март 2011 г.

Февраль 2011 г.

Январь 2011 г.

Декабрь 2010 г.

ноябрь 2010 г.

октябрь 2010 г.

Сентябрь 2010 г.

август 2010 г.

июль 2010 г.

июнь 2010 г.

Май 2010 г.

Апрель 2010 г.

Март 2010 г.

Февраль 2010 г.

Январь 2010 г.

2005 ~ 2009

 

Праздничные специальные предложения B&H

 

Помогите мне помочь вам

Я поддерживаю свою растущую семью через этот веб-сайт, как бы безумно это ни звучало.

Если вы найдете это столь же полезным, как книга, которую вам, возможно, пришлось купить, или мастер-класс, который вы, возможно, пришлось взять, не стесняйтесь помочь мне продолжать помогать всем.

Если вы получили свое снаряжение по одной из моих ссылок или помогли другим способом, вы — семья. Это замечательные люди, такие как вы, которые позволяют мне постоянно добавлять на этот сайт. Спасибо!

Если вы еще не помогли, сделайте это и подумайте о том, чтобы помочь мне подарком в размере 5 долларов.

Самая большая помощь, когда вы используете любую из этих ссылок, когда вы получаете что угодно, независимо от страны, в которой вы живете.Это вам ничего не стоит, и это самый большой источник поддержки для этого сайта и, следовательно, для моей семьи. eBay — это всегда азартная игра, но во всех других местах всегда лучшие цены и обслуживание, поэтому я использовал их еще до того, как появился этот сайт. Всем рекомендую лично .

Спасибо за прочтение!

Кен

Главная  Пожертвовать  Новый   Поиск  Галерея  Обзоры  Как сделать  Книги  Ссылки  Семинары  О нас Контакты

Обслуживание и ремонт Chrysler в Авроре, Колорадо

Обслуживание и ремонт Chrysler в Авроре, Колорадо

Вы ищете надежный автосервис для вашего Chrysler в районе метро Аврора и Денвер? Если это так, ищите не дальше, чем Aurora AutoPros! Наши автомеханики сочетают в себе новейшие технологии с креативным мышлением, чтобы предоставить вам наилучший уход за вашим Chrysler.

Вы купили свой Chrysler, чтобы безопасно и надежно перевозить свою семью по улицам Авроры и пригородам Денвера. Наша область богата живописными маршрутами и местностью, но также имеет суровые и экстремальные погодные условия. Чтобы ваш Chrysler работал как новый, необходимо иметь отличный план профилактического обслуживания. К счастью для вас, Aurora AutoPros верит в силу профилактического обслуживания.

Зачем покупать безопасный и надежный роскошный семейный автомобиль, если вы доверите заботу о своем Chrysler любому магазину? Aurora AutoPros ставит перед собой амбициозную цель поднять планку обслуживания клиентов и опыта в сфере авторемонта не только в Авроре, но и в окрестностях.Мы стремимся сделать это, тщательно проверяя и диагностируя ваш Chrysler, а также открыто сообщая о наших выводах. Мы не хотим выполнять работу, пока не покажем вам, зачем она нужна. В довершение всего мы предлагаем общенациональную гарантию на 3 года или 36 000 миль пробега. Запишитесь на прием для вашего Chrysler сегодня, и вскоре вы будете так же довольны, как клиент в пятизвездочном отзыве ниже:

«Отличный сервис. Они были очень профессиональны, уважительны и эффективны. Получил полную диагностику своего автомобиля, в которую вошли фото основных проблем.Хосе терпеливо объяснил проблемы, решения и дал мне разумную цену. Начали работу, быстро закончили и дали гарантию на свою работу. «Аврора АвтоПрос» — это место, куда можно обратиться за отличным сервисом!» — Zaida K.

Назначьте встречу для вашего Chrysler с Aurora AutoPros уже сегодня! Кроме того, следите за нами в Facebook и на наших каналах в социальных сетях и смотрите, какими интересными, развлекательными, образовательными и забавными вещами мы делимся с нашим сообществом. Мы находимся по адресу: 231 Airport Blvd, Suite B, Aurora, CO 80011, и работаем с понедельника по пятницу с 8:00 до 18:00.Мы поднимаем планку в авторемонте, потому что мы заботимся.

Вопросы интерпретации активности ингибиторов Aurora-A in vivo

Expert Opin Ther Targets. Авторская рукопись; Доступно в PMC 2016 Feb 1.

Опубликовано в окончательной отредактированной форме AS:

PMCID: PMC4294965

NIHMSID: NIHMMS645215

ELENA SHAGISULTANOVA

1 Департамент медицинской онкологии, Центр рака Фокс-Чейз, Филадельфия, Па , 19111

Роланд Л.Dunbrack, Jr.

2 Программа развивающей терапии, Онкологический центр Фокса Чейза, Филадельфия, Пенсильвания, 19111

Эрика А. Големис

2 Программа развивающей терапии, Онкологический центр Фокса Чейза, 191, PA 191, Филадельфия, 191, 191

1 Отделение медицинской онкологии, Онкологический центр Фокс Чейз, Филадельфия, Пенсильвания, 19111

2 Программа развивающей терапии, Онкологический центр Фокс Чейз, Филадельфия, Пенсильвания, 19111

Автор, Эрика Голем, соответствующий: 903 Онкологический центр Фокса Чейза, 333 Cottman Ave., Philadelphia, PA 19111, (215) 728-2860 тел., -3616 факс, [email protected] См. другие статьи PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Введение

На основании ее роли в качестве киназы, регулирующей митотический цикл, сверхэкспрессируемой и связанной с анеуплоидией при раке, для киназы Aurora-A (AURKA) были разработаны низкомолекулярные ингибиторы. В доклинических и клинических исследованиях эти агенты показали эффективность в индукции стабильного заболевания или терапевтического ответа. При оптимизации использования ингибиторов Aurora-A крайне важно иметь надежные возможности для измерения киназной активности Aurora-A в опухолях.

Охваченные области

мы предоставляем обзор молекулярных механизмов митотической и немитотической активации киназы Aurora-A и взаимодействия Aurora-A с ее регуляторными партнерами. Как правило, активность Aurora-A измеряют с помощью фосфоантител, нацеленных на аутофосфорилированный эпитоп T288. Однако недавние исследования выявили альтернативные способы контроля активации Aurora-A, включая аллостерическую регуляцию партнерами, фосфорилирование альтернативных активирующих остатков (S51, S98), дефосфорилирование ингибирующих сайтов (S342) и фосфорилирование T288 альтернативными киназами, такими как ферменты Pak. .Дополнительная работа показала, что относительное количество партнеров Aurora-A может влиять на активность ингибиторов Aurora-A, и что активация Aurora-A также происходит в интерфазных клетках.

Экспертное мнение

В совокупности эта работа указывает на необходимость всестороннего анализа активности Aurora-A и экспрессии партнеров Aurora-A для стратификации пациентов на предмет вероятного терапевтического ответа.

Ключевые слова: Аллостерическая активация, AURKA, Аврора-А, рак, NEDD9, PAK, фосфорилирование, таргетная терапия, TPX2

1.Введение

По мере того, как лечение рака все больше основывается на знаниях о точных онкогенных поражениях, которые стимулируют рост опухоли, зависимость медицинской онкологии от терапии, направленной на белок, продолжает расти. Многие опухоли «пристрастились» к постоянной активности онкогенных белков для их выживания [1], и некоторые из этих белков стали ценными мишенями для лекарств. В настоящее время большинство таргетных препаратов предназначены для ингибирования ферментов и, в частности, киназ, так что потеря активности зависимой клетки приводит к гибели опухолевой клетки.Эффективное применение целевых ингибиторов киназы в клинике требует идентификации и проверки условий, в которых терапевтическая мишень является функционально важной, как правило, в активном состоянии, а также требует возможности подтверждения того, что терапевтические агенты ингибируют мишень в опухолях. В доклинических и клинических условиях оценку состояния активации киназы-мишени и ее ингибирования целевым лекарственным средством часто удобнее всего проводить с использованием антител к аутофосфорилированному эпитопу киназы-мишени.В некоторых случаях, когда антитела к таким эпитопам недоступны, измеряют фосфорилирование непосредственно нижестоящего субстрата интересующей киназы. Например, фосфорилирование MEK1/2 на S218/S222 часто используется в качестве суррогатного репортера активности RAF [2]. Информация об активации мишени помогает дать точную оценку клинического ответа на таргетные препараты.

В этой статье мы сосредоточимся на недооцененной проблеме, которая может затруднить клиническое применение ценных таргетных препаратов.Это возможность того, что некоторые киназы могут быть активированы несколькими различными способами, что может запутать стандартные средства обнаружения и/или ингибирования активности киназы. Исторически сложилось так, что многие онкогенные ферменты, включая киназы, идентифицировали как автоактивирующиеся (обычно из-за активирующих мутаций в каталитическом домене) или, альтернативно, как активируемые белок-белковым взаимодействием с одним восходящим партнером, который вызывал аллостерические изменения, поддерживающие автофосфорилирование. . Однако по мере того, как картирование белковых сигнальных сетей становится более полным, эта относительно простая парадигма часто подвергается сомнению.Все чаще обнаруживается, что лекарственные мишени, представляющие значительный терапевтический интерес, активируются несколькими способами, различными предшествующими факторами. Следовательно, классические клинические индикаторы активации мишени могут не применяться в зависимости от вышестоящего механизма активации. В качестве конкретного примера этой проблемы мы сосредоточимся на одной важной терапевтической мишени: онкогенной киназе Aurora-A, эволюционно консервативной серин/треонинкиназе, необходимой для митотической прогрессии.

Aurora-A сверхэкспрессируется во многих опухолях, возникающих из молочной железы, толстой кишки, яичников и других тканей, и функционирует как онкоген при экзогенной экспрессии в многочисленных моделях клеточных линий [3–7].Гиперэкспрессия Aurora-A вызывает появление сверхштатных центросом и мультиполярных веретен вследствие нарушения цитокинеза, что приводит к анеуплоидии [8]. Высокая экспрессия Aurora-A у онкологических больных является независимым предсказательным и прогностическим маркером, связанным с устойчивостью к таксанам [9] и снижением выживаемости [10]. Aurora-A напрямую взаимодействует с важными онкогенами и генами-супрессорами опухолей: фосфорилирует Src [11], стабилизирует N-myc [12], а также фосфорилирует и подавляет основной супрессор опухолей p53 [13].Р53, в свою очередь, негативно регулирует Aurora-A посредством как транскрипционных, так и посттрансляционных механизмов [14]. И наоборот, инактивация p53, характерная для солидных опухолей, поддерживает индукцию Aurora-A с сопутствующей анеуплоидией и хромосомной нестабильностью [15]. Следовательно, Aurora-A была популярной мишенью для разработки противораковых агентов, а ингибитор Aurora-A алисертиб в настоящее время проходит многочисленные клинические испытания на поздних стадиях [16, 17].

В доклинических исследованиях, поскольку доступные биообразцы обычно представляют собой ткани, фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE), об активности Aurora-A обычно сообщается на основе измерения аутофосфорилирования остатка T288 в активации или Т-петле.Многие оценки алисертиба и других ингибиторов Aurora-A были основаны на анализе фосфорилирования T288. За последние несколько лет в исследованиях сигнальной активности Aurora-A возникло несколько противоречивых вопросов: активация, не связанная с фосфорилированием T288, немитотическая активность Aurora-A и низкое качество антител. Однако, возможно, из-за эффекта бункера, который часто отделяет работу в области биохимии и структурной биологии от доклинической и клинической разработки лекарств, многие из этих вопросов обычно не учитываются в клинических исследованиях.

Оценка этих вопросов в сочетании с точным пониманием того, насколько хорошо препараты, нацеленные на Aurora-A, ингибируют свою мишень, имеет важное значение для разработки эффективных клинических стратегий. В этой статье мы описываем митотические и немитотические функции Aurora-A, обсуждаем активацию Aurora-A, зависящую или независимую от фосфорилирования T288, и подчеркиваем роль других киназ и фосфатаз, регулирующих активность Aurora-A. Затем мы помещаем эту работу в контекст обсуждения алисертиба, самого передового и клинически эффективного из нацеливающих агентов Aurora-A.

2. Митотическая активация Aurora-A: важная роль аутофосфорилирования T288

В своей хорошо подтвержденной роли митотического регулятора (обзор в Nikonova et al. [8]) Aurora-A накапливается в центросоме в G2 , и становится высокоактивным на переходе G2/M. Aurora-A способствует созреванию центросом, рекрутируя γ-тубулин, центросомин и другие центросомные белки в перицентриолярную массу [18, 19]. Вхождение в митозы катализируется киназной активностью циклинзависимой киназы 1 (CDK1) в комплексе с циклином B1 [20].Aurora-A фосфорилирует CDK-активирующую фосфатазу CDC25B и поддерживает активацию комплекса CDK1/циклин B1, что позволяет войти в митоз [21]. И наоборот, активный CDK1 в комплексе с другим циклином (B2) способствует дальнейшей митотической активации Aurora-A [22]. В дополнительной промитотической активности Aurora-A фосфорилирование белка BRCA1 снижает контроль контрольной точки G2/M [23], а фосфорилирование Aurora-A белка семейства RAS RALA регулирует слияние митохондрий, что важно для равного постмитотического разделения клеток. митохондрии между дочерними клетками [24].

Aurora-A остается активной в течение фазы M, поддерживает функционирование центросом как биполярных центров организации микротрубочек и координирует сегрегацию хромосом. Начиная с профазы, Aurora-A распространяется от центросомы к веретену, а в метафазе и позднее локализуется в средней зоне, регулируя динамику веретена [25]. У всех многоклеточных животных, оцененных на сегодняшний день, мутация или истощение Aurora-A вызывает образование веретен с аномально организованными полюсами, включая характерные монополярные структуры и слабые, редкие или короткие астральные микротрубочки [8].Перед цитокинезом комплекс APC/Cdh2 убиквитинирует Aurora-A и нацеливает его на протеасомную деградацию в средней части тела; отсутствие деградации Aurora-A связано с нарушением цитокинеза [25]. Помимо протеасомной деградации, Aurora-A митотически SUMOилирована, что может способствовать контролю его локализации [26].

Об активации Aurora-A часто сообщают на основе измерения фосфорилирования остатка T288 в петле активации (все нумерации основаны на Aurora-A человека) [27].Соседний остаток, T287, иногда фосфорилирован [28] и частично избыточен с T288, следуя модели, установленной для других киназ [29]. Однако одно интересное недавнее исследование показало, что, хотя фосфорилирование Т288 или Т287 по отдельности активирует Aurora-A, фосфорилирование обоих вместе может ингибировать активность киназы за счет конкуренции за сайт связывания, что ясно указывает на необходимость дополнительных исследований [30]. показывает выравнивание всей петли активации последовательностей Aurora A и Aurora B от нескольких видов.T288 сохраняется во всех формах Aurora-A и Aurora-B; T287 менее консервативен в Aurora-A и отсутствует в Aurora-B. Петля активации почти всех киназ начинается с консервативного «мотива DFG» (последовательность Asp-Phe-Gly) и заканчивается последовательностью, сходной с APE (Ala-Pro-Glu; Aurora A и B имеют Pro-Pro-Glu). Конформация петли различна для активных и неактивных киназ и в общих чертах классифицируется по положению последовательности DFG в петле активации, иногда называемой DFG-in для активных киназ и DFG-out для некоторых неактивных киназ.В большинстве неактивных киназ петля активации может располагаться в нескольких различных положениях в зависимости от связанного ингибитора. Для Aurora A один из них показан на . Эта структура была названа DFG-up Dodson et al. поскольку Phe петли DFG необычным образом направлен вверх далеко в N-концевой домен [31]. Многие структуры Aurora A демонстрируют эту конформацию DFG-up [8].

А . Выравнивание последовательностей петли активации Aurora-A и родственного белка Aurora-B различных видов.Полностью консервативные остатки отмечены синим цветом; сайт фосфорилирования T288 показан красным.

А . Ингибируемая лекарственными средствами неактивная форма каталитического домена Aurora-A; окрашивается от синего до красного от амино- до карбокси-конца [119]. Ингибитор, 2–4-бисанилинопиримидин (розовый), показан в палочках. Петля активации показана пурпурным цветом и может блокировать активный сайт. Phe275 петли DFG (Asp-Phe-Gly) показан на фигурах палочек и находится в конфигурации «DFG-up» [31]. Б . Фосфорилированный активный каталитический домен Aurora-A, связанный с TPX2 (бежевая лента). Петля активации находится в активном положении DFG-in с фосфорилированием на T287 и T288 (обозначены TPO287 и TPO288), показанными палочками. Phe275 мотива DFG петли активации и Asp256 мотива HRD в активном центре, который связывает OH-группы субстрата Ser и Thr, также показаны в палочках. В состав входит связанный АДФ и два атома магния (желтые сферы). Также отмечен Ser342, дополнительный регуляторный сайт фосфорилирования Aurora-A, обсуждаемый в тексте.

Хотя Aurora-A способна к аутофосфорилированию T288 [32], ряд белков непосредственно связывается с Aurora-A и регулирует этот процесс. Структурная основа активации одним партнером, TPX2, была идентифицирована первой и наиболее полно охарактеризована [33–38]. Активация GTPase Ran во время разрушения ядерной оболочки высвобождает TPX2 из комплекса, ингибирующего импортин, что позволяет ему связываться с Aurora-A. Это способствует конформационному изменению Aurora-A, связанному с аутофосфорилированием T288, и перемещает активационную петлю в расширенное положение от активного сайта.Phe DFG теперь направлен вниз и под С-спираль N-концевого домена в активной конформации. Это показано на рисунке, где изображен домен киназы Aurora-A со связанным АТФ, двумя ионами магния в активном центре и фосфорилированием остатков T287 и T288 петли активации. TPX2 показан в виде бежевой ленты, связанной с N-концевым доменом вдали от активного сайта. В этом положении активирующая петля защищена от дефосфорилирования негативными регуляторами Aurora-A и доступна для взаимодействия с субстратами Aurora-A [37–43].Порядок связывания TPX2 и фосфорилирования Aurora-A in vivo неизвестен, хотя было высказано предположение, что низкие уровни аутофосфорилирования Aurora-A происходят в центросомах на ранних стадиях митоза, за которыми следует аллостерическая активация TPX2. способствуя высоким уровням действий, поскольку центросома собирает микротрубочки веретена [32]. Взаимодействие TPX2 также помогает нацеливать Aurora-A на митотические веретена, расположенные проксимальнее субстратов [41].

Оценка активности киназы Aurora-A на основе использования антител к фосфорилированному эпитопу T288 может предоставить полезную информацию, но особенно в последние годы имеет некоторые связанные с этим проблемы.Одной из проблем является ограничение качества доступных коммерческих реагентов для фосфо-T288 Aurora-A. Было показано, что коммерчески доступные фосфоантитела T288 перекрестно реагируют с членом семейства, Aurora-B, при некоторых условиях [44] (см. ). Хотя отрицательные результаты опубликовать сложно, в межлабораторных коммуникациях было отмечено многочисленными группами (включая нашу группу), что качество антител к фосфо-Т288 Аврора-А стало непостоянным. В частности, реактивность коммерческих антител против мышиного фосфо-T288 Aurora-A ухудшилась примерно с 2010 года для приложений, включая вестерн-блоттинг, иммуногистохимию и иммунофлуоресценцию, о чем свидетельствует тот факт, что за последние два года появилось очень мало публикаций с использованием антител. к мышиному фосфо-T288 Aurora-A для изучения эндогенного белка Aurora-A.Это может ограничить доклинические исследования ингибиторов Aurora-A, особенно при использовании моделей рака мышей и клеточных линий. Это может отражать тот факт, что последовательность сайта активации мыши однозначно содержит RRTT 288 M, а не RRTT 288 L, обнаруженный у большинства позвоночных (1), с этим изменением, снижающим аффинность антитела к эпитопу. Для тканей человека, несмотря на то, что достигается гораздо лучшая эффективность, большинство антител фосфо-T288 имеют множественные перекрестно реагирующие полосы в Вестерн-блотах, что вызывает некоторые предостережения в отношении интерпретации оценок иммуногистохимии.Помимо качества реагентов, более важной проблемой при использовании антител к фосфо-T288 Aurora-A для измерения активности этого белка является растущее количество публикаций, указывающих на то, что активация Aurora-A основана не только на аутофосфорилировании T288. Скорее, Aurora-A может активироваться другими путями, а T288 может фосфорилироваться другими киназами, как обсуждается ниже.

3. Активация Aurora-A за исключением аутофосфорилирования T288

В то время как большая часть литературы, посвященной активации Aurora-A, фокусируется на сайте фосфорилирования T-петли T288, это одно из самых ранних исследований митотической активации Aurora-A с использованием Xenopus показал, что активная Aurora-A также фосфорилирована по остатку S51 и не имеет фосфорилирования по S342 (все нумерации основаны на Aurora-A человека) [27].Последующие исследования подтвердили эти сайты фосфорилирования в митозе и мейозе и выявили дополнительные сайты митотического фосфорилирования на S53/S54, S66/S67, S89 и S98 [27, 45-49]. Эти сайты фосфорилирования функционально важны.

Во-первых, аутофосфорилирование Aurora по остатку S342 на спирали αG С-концевого домена (см. ) ограничивает активность Aurora-A [27, 50, 51] и обеспечивает механизм тонкой регуляции активного Aurora-A. в митозе. Как показано на моделях Xenopus, мутация S342D (имитирующая конститутивное фосфорилирование серина) полностью блокирует активность Aurora-A [27, 51], в то время как мутация S342A делает Aurora-A устойчивой к ингибированию после повреждения ДНК [52].Аутофосфорилирование Aurora-A по остатку S342, в свою очередь, индуцируется киназой 3 гликогенсинтазы (GSK-3), задающей «праймирующее» фосфорилирование Aurora-A по остаткам S283 и S284, расположенным в петле активации непосредственно перед Т288. 51]. Замена серина на аланин в сайтах праймирования S283 и S284 предотвращает их фосфорилирование и приводит к конститутивно активной форме Aurora-A, дефосфорилированной по остатку S342. Замена серина на аспарагиновую кислоту в сайтах праймирования имитирует их конститутивное фосфорилирование и приводит к полностью неактивному автофосфорилированию Aurora-A по S342 [51].В качестве доказательства важности этого механизма контроля активации Sarkissian et al. показали, что отсутствие фосфорилирования в S342 предсказывало активность Aurora-A лучше, чем фосфорилирование в T288 [51].

Дополнительная митотическая регуляция Aurora-A обеспечивается связыванием Ca 2+ -лигандного кальмодулина (CaM) с неструктурированным амино-концевым доменом Aurora-A [46]. Связывание Ca 2+ /CaM индуцировало автофосфорилирование Aurora-A по остатку S51 и близлежащим остаткам S53/S54, S66/S67 и S98 в неупорядоченной амино-концевой области Aurora-A (остатки 1–121), что было обнаружено по массе спектроскопия [46].Этот анализ не обнаружил фосфорилирования Т288, хотя не было установлено, не произошло ли это фосфорилирование или пептид, содержащий Т288, плохо определялся масс-спектрометрией. Мутации внутри или вблизи пяти сайтов фосфорилирования Ca 2+ /CaM (S51, S53, S54, S66 и S61) нарушили связывание Aurora-A с CaM и по крайней мере с одним коактиватором, NEDD9, и нарушили Aurora-A. Функции, связанные с митотической прогрессией, приводят к высокой частоте митотической катастрофы при переходе метафаза-анафаза; тогда как мутация соседнего сайта S98A неспецифически нарушала функцию Aurora-A [45, 46].Важно отметить, что митотическое фосфорилирование на S51 было предложено для защиты Aurora-A от деградации до конца митоза [27, 53], как обсуждается ниже.

Совсем недавно нуклеофосмин (B23) был идентифицирован как дополнительный активирующий партнер Aurora-A [47]. Нуклеофосмин, совместно локализующийся с Aurora-A в центросоме, индуцирует аутофосфорилирование Aurora-A по остатку S89, но не T288. Фосфорилирование S89 было необходимо для митотического фосфорилирования субстрата Aurora-A CDC25B in vivo , что позволяет предположить, что оно необходимо, по крайней мере, для некоторых событий Aurora-A-зависимого митотического фосфорилирования [47].

Важно отметить, что недавно было показано, что даже хорошо изученный активатор Aurora-A TPX2 проявляет часть своей активности посредством механизмов, не связанных с индукцией аутофосфорилирования T288. В элегантных исследованиях Dodson и Bayliss исследовали киназную активность T288-нефосфорилируемой (мутант T288A) Aurora-A с TPX2 и без нее, а также T288-фосфорилированной Aurora-A с TPX2 и без нее [42]. Неожиданно связывание TPX2 увеличило каталитическую активность T288A Aurora-A в 15 раз, в то время как фосфорилирование T288 также увеличило активность Aurora-A: эффект связывания TPX2 и автофосфорилирования Aurora-A, связанных вместе, был точной суммой их индивидуальных вкладов в катализ. .Авторы предложили пересмотренную модель активации Aurora-A, в которой первым шагом было снижение подвижности петли активации, которое могло быть вызвано либо связыванием TPX2, либо фосфорилированием T288. Эти очень важные результаты свидетельствуют о том, что T288-нефосфорилированная Aurora-A, связанная с митотическим веретеном с помощью TPX2, является каталитически активной и что измерение фосфорилирования T288 не всегда является суррогатом состояния активации Aurora-A [42].

4. Контроль активации Aurora-A в центросоме путем взаимодействия с дополнительными киназами, фосфатазами и каркасными белками

В центросоме Aurora-A связывается с каркасными факторами CEP192, NEDD9, Ajuba, членами семейства киназ PAK и нуклеофосмин [35, 47, 54–56], а также активирующие белки Arpc1b, киназу LIM1, ингибитор фосфатазы I-2, BORA, TACC3 и TPX2 [33, 56–60].Считается, что активирующая функция некоторых белков, взаимодействующих с Aurora-A, таких как CEP192, включает рекрутирование в центросому, увеличивая локальную концентрацию Aurora-A [35, 61, 62], в то время как другие, такие как NEDD9, этого не делают. влияют на рекрутирование центросом [54]. Важно отметить, что при раке амплификация или сверхэкспрессия гена Aurora-A приводит к аномальной локализации белка Aurora-A в цитоплазме или даже в ядерном компартменте. Разумно предположить, что активация нецентросомной Aurora-A при раке может подвергаться другим ограничениям, чем центросомная Aurora-A в нетрансформированных клетках, но до настоящего времени эта тема не рассматривалась строго.Это заслуживает внимания, поскольку было показано, что ряд белков, активирующих Aurora-A, обсуждаемых ниже, сверхэкспрессируются или активируются в подмножестве опухолей и обладают проонкогенной функцией, которая может быть связана или не быть связана с контролем Aurora-A. -А активность.

4.1 Белковые взаимодействия, которые активируют Aurora-A

В кратком обзоре некоторых известных активаторов Aurora-A, связанных с раком (), связывание каркасного белка NEDD9 с несколькими сайтами на Aurora-A, вероятно, защищает Aurora-A от деградации и способствует конформационным изменениям, усиливающим активацию [63].Истощение NEDD9 не влияет на накопление Aurora-A в центросоме, но блокирует фосфорилирование T288 и активацию Aurora-A при вступлении в митоз. Сверхэкспрессия NEDD9 индуцирует гиперактивацию Aurora-A и фосфорилирование T288 и продуцирует клетки как с мультиполярными веретенами, так и с нештатными центросомами и нарушением цитокинеза [54, 64]. NEDD9 обычно сверхэкспрессируется при раке и способствует инвазии и метастазированию [63, 65].

Активирующие и инактивирующие взаимодействия и сайты фосфорилирования Aurora-A.Подробности смотрите в тексте.

Центросомный каркасный белок LIM-домена Ajuba связывает Aurora-A и, как сообщалось, индуцирует его аутофосфорилирование на T288 [56]. Было показано, что это взаимодействие важно для активации комплекса циклин-В/CDK1 и для вовлечения клеток в митоз. Истощение Ajuba предотвращает активацию Aurora-A в центросомах в поздней фазе G2 и ингибирует вступление в митоз [56]. Однако несколько исследований предлагают более сложную интерпретацию активности Ajuba.В генетических исследованиях Drosophila, Sabino et al. показали, что Ajuba не влияет на активацию Aurora-A per se, но удерживает активированную Aurora-A в центросоме [66]. Другое исследование показало, что мутации в Aurora-A, которые нарушают взаимодействие N-концевых и C-концевых доменов (AurA-K250G и AurA-D294G/Y295G), нарушают активацию Aurora-A [67], а также устраняют связывание с Ajuba, хотя другие работа той же группы предполагает, что Ajuba может влиять на внутримолекулярную динамику Aurora-A, влияя на аутофосфорилирование [68, 69].

Центросомный белок Arpc1b взаимодействует с N-концевым доменом Aurora-A и, вероятно, изменяет конформацию активного сайта Aurora-A, вызывая увеличение фосфорилирования T288. Сверхэкспрессия Arpc1b приводит к аномальной центросомной амплификации, тогда как истощение Arpc1b резко снижает способность клеток вступать в клеточный цикл; это сопровождается неспособностью накапливать активную Aurora-A в центросоме при переходе G2/M [58].

LIM-киназа 1 (LIMK1) колокализуется с Aurora-A в центросоме между ранней профазой и анафазой и фосфорилирует Aurora-A.Мишенью LIMK1 является не T288, но иным образом она не определена [70].

Ингибитор фосфатазы I-2 является активирующим партнером Aurora-A с двумя отдельными доменами, каждый из которых отдельно влияет на активацию Aurora-A: C-концевой мотив вызывает аллостерическую активацию Aurora-A (независимо от фосфорилирования T288), в то время как N-концевой мотив ингибирует действие протеинфосфатазы 1 при дефосфорилировании Т288 [57].

Недавно описанный активатор Aurora-A, BORA, не локализуется в центросомах.BORA является ядерным белком, но высвобождается из ядра в цитоплазму при вступлении в митоз, где он может связывать и активировать Aurora-A, способствуя аутофосфорилированию T288 in vitro [59]. Скорее всего, BORA действует ниже других белков, которые взаимодействуют с Aurora-A до того, как произойдет разрушение ядерной оболочки, и, по крайней мере, одно исследование предполагает, что первичная активность BORA более важна для активности дополнительных митотических киназ, таких как PLK1, в физиологических условиях в культуре. клетки [71].

Киназы PAK особенно мешают использованию фосфорилирования T288 в качестве показателя активации Aurora-A. Киназы PAK представляют собой семейство из 6 паралогичных серин-треониновых киназ, которые часто активируются при раке и способствуют агрессивному росту опухоли [72]. Было показано, что каждый из PAK1, PAK2 и PAK3 связывает Aurora-A и индуцирует фосфорилирование сайта петли активации T288 [55]. Интересно, что в том же исследовании было показано, что они также фосфорилируют ингибирующий сайт S342 [55], подразумевая, что киназы PAK могут аналогичным образом накладывать активирующие и инактивирующие сигналы на Aurora-A.Из-за этой двойственности действия и того, что киназы PAK независимо фосфорилируют остаток T288, определение активности Aurora-A, основанное на измерении Aurora-A T288, вероятно, будет неточным в опухолях, экспрессирующих высокие уровни PAK.

4.2 Белковые взаимодействия, ингибирующие Aurora-A

Список известных в настоящее время ингибиторов Aurora-A () значительно короче активаторов; он включает протеинфосфатазы 1, 2А и 6 (РР1, РР2А, РР6), р53 и Gadd45a. Дефосфорилирование T288 с помощью PP1 ограничивает активность Aurora-A [73].Как упоминалось выше, ингибитор фосфатазы I-2 противостоит PP1 в этой функции, тем самым усиливая активность Aurora-A [57]. Любопытно, что некоторые данные свидетельствуют о том, что сайт связывания PP1 находится рядом с негативным регуляторным сайтом S342, что соответствует мотиву RVEF в остатках 343-354; и что мутация этих остатков с целью устранения связывания PP1 привела к производному киназы Aurora-A, которое было гиперфосфорилировано, но также неактивно [73]. Эти данные предполагают, что PP1 может комплексно влиять на Aurora-A, подобно киназам PAK, и предполагают осторожность при оценке активности Aurora-A в опухолях с аномальной функцией PP1.Совсем недавно холофермент PP6 был описан как основной негативный регулятор активации Aurora-A, ингибирующий стабильность комплекса Aurora-A/TPX2 [74].

Наконец, центросомная популяция опухолевого супрессора р53 ингибирует киназную активность Aurora-A и подавляет онкогенную трансформацию клеток, индуцированную сверхэкспрессией Aurora-A [14, 75]. Gadd45a, индуцируемый повреждением ДНК белок, который регулируется опухолевыми супрессорами p53 и BRCA1, физически связывается с Aurora-A, сильно ингибирует активность киназы Aurora-A и противодействует индуцированной Aurora-A амплификации центросом [76].

Вероятно, существуют дополнительные регуляторы активности Aurora-A, которые еще не определены. Это благодатная почва для дальнейших исследований.

5. Связь фосфорилирования Aurora-A с экспрессией общего белка и чувствительностью к ингибированию белка к деградации.Вкратце, в то время как большинство солидных опухолей имеют повышенные уровни белка Aurora-A, только меньшинство имеет амплификацию гена Aurora-A, что означает, что посттранскрипционные механизмы стабилизации Aurora-A очень важны при раке [8]. В конце митоза Aurora-A дефосфорилируется, полиубиквитинируется комплексом/циклосомой, стимулирующим анафазу (APC/C), и подвергается деградации протеасомой. APC/C-зависимая деградация Aurora-A требует субъединиц узнавания субстрата CDh30 и CDh2 [77].Сверхэкспрессия CDh2 снижает уровни Aurora-A, тогда как нокдаун CDh2 или мутация сайта связывания Aurora-A CDh2 приводит к повышенной экспрессии Aurora-A [25, 78].

Две направленные на деградацию последовательности на Aurora-A опосредуют разрушение комплексом APC/C: карбоксиконцевой D-бокс (деструкционный бокс) и аминоконцевой А-бокс [53, 65, 79]. Фосфорилирование Aurora-A на S51 в A-box ингибирует CDh2-APC/C-опосредованное убиквитинирование и последующую деградацию [78]. Отмеченный выше ингибитор Аврора-А РР1 удаляет фосфорилирование S51 и Т-петли Т288, усиливая процесс деструкции [8].

Несколько белков участвуют в регуляции стабильности AURKA либо путем прямого деубиквитинирования Aurora-A (USP2a) [80], либо путем вмешательства в убиквитинирование Aurora-A с помощью APC/C (NEDD9, PUM2, TPX2, LIMK2, PHDL1) [80] 40, 65, 81–83]. Например, NEDD9 связывается с Aurora-A через митоз, поддерживает его фосфорилирование T288 и препятствует способности комплекса APC/C убиквитинировать Aurora-A, предотвращая связывание CDh2 [65]. Делеция или мутация NEDD9 резко снижает уровень белка Aurora-A и активность киназы.Фосфорилирование NEDD9 с помощью Aurora-A служит петлей отрицательной обратной связи для регулирования уровней активного Aurora-A. Обилие NEDD9 при эпителиальном раке и дефосфорилирование NEDD9 фосфатазой PP2A [84] создают постоянный запас нефосфорилированного NEDD9, который может стабилизировать и активировать Aurora-A [65].

Приведенные выше примеры подразумевают, что клинические измерения активности Aurora-A или активности ингибитора Aurora-A, основанные на минимальном фосфорилировании T288, необходимо нормализовать до уровня общего Aurora-A, учитывая, что фосфорилирование влияет на процессинг Aurora-A посредством клеточной деградации. техника.В качестве дополнительного осложнения два недавних исследования показали, что повышенное взаимодействие активирующих партнеров с Aurora-A (на основе амплификации или сверхэкспрессии при раке) может снижать эффективность низкомолекулярного ингибитора Aurora-A алисертиба (обсуждается ниже) [65, 85]. ]. Детальный биофизический анализ для анализа этого механизма резистентности еще не проводился. Потенциально резистентность отражает аллостерические изменения в конфигурации Aurora-A, которые влияют на Т-петлю или нарушают взаимодействие дефосфорилированной Aurora-A с белками, нацеленными на разрушение CDh2/CDh30.Расследование явно необходимо.

6. Активация Aurora-A в немитотических контекстах

Как правило, обнаружение положительного сигнала фосфорилирования Aurora-A T288 приписывается клеткам в митозе. Однако многочисленные недавние исследования показали более разнообразные, немитотические функции Aurora-A, регулирующие выпячивание и резорбцию клеточных ресничек [86], участвующие в клеточной передаче сигналов кальция [46, 87] и организующие ремоделирование микротубулярного цитоскелета во время удлинения нейритов. [28].Учитывая недавний характер этих открытий, степень, в которой межфазная активность Aurora-A способствует измерению общей клеточной активности Aurora-A, неясна. Кинетика активации Aurora-A в интерфазе явно отличается от таковой в митозе. Кроме того, инактивация Aurora-A в интерфазе, по-видимому, не связана с деградацией киназы.

В кратком изложении результатов большинство клеток млекопитающих имеют единственную неподвижную ресничку, которая простирается от перимембранного базального тела и действует как приемник внеклеточных механических и химических сигналов.Потеря ресничек с клеточной поверхности была связана с более агрессивными фенотипами в трансформированных клетках и многими типами рака [88]. Однако для некоторых типов опухолей, таких как медуллобластома, динамика ресничек более сложна, поскольку реснички необходимы для индукции опухоли белком Smoothened, реагирующим на Hedgehog, который локализуется в ресничках, но не подходит для индукции с помощью Gli2, нижестоящего преобразователя передачи сигналов Hedgehog. 89]. Помимо пути Hedgehog, PDGFR-α передает сигналы от ресничек [90], в то время как сигнальные пути, зависящие от ресничек, включают mTOR, VHL, TSC и WNT [91], все они имеют большое значение для рака.

Базальное тело реснички дифференцируется из центросомы (важного места действия Aurora-A) в фазе G0/G1, но повторно дифференцируется в центросому позже в клеточном цикле. Выпячивание и резорбция ресничек регулируется клеточным циклом, при этом некоторые реснички резорбируются, когда покоящиеся клетки перемещаются из G0 в G1 (или в начале G1 в циклических клетках), и все реснички резорбируются до митоза [92]. Резорбция реснички контролируется активацией Aurora-A в базальном теле реснички [86]. Стимулы, ведущие к разборке ресничек, активируют Aurora-A в базальном теле в клетках G0/G1 — время, когда многие из канонических факторов, активирующих Aurora-A, не считались активными.Эта активация длится примерно час, отражается фосфорилированием T288 и зависит по крайней мере от одного митотического партнера Aurora-A, NEDD9. После цилиарной резорбции Aurora-A перестает быть активной (судя по аутофосфорилированию Т288 и измерениям активности киназы in vitro), но не подвергается деградации. Эти данные поднимают интересную возможность того, что ингибирование T288-фосфорилированной Aurora-A может по-разному регулироваться и оказывать разные эффекты в опухолях, которые зависят от локализованной в ресничках онкогенной передачи сигналов.

Дефекты ресничек тесно связаны с клинически важными «цилиопатиями», включая поликистозную болезнь почек (PKD), нефронофтиз, синдром Жубера и др. [93]. Митотическая активация Aurora-A за счет связывания Ca 2+ /CaM, отмеченная выше, была впервые обнаружена в контексте интерфазной передачи сигналов в доклинических моделях PKD. Цилиопатия PKD связана с дефектами внутриклеточной передачи сигналов кальция с помощью локализованного в ресничках кальциевого канала PKD2. Плотникова и др. обнаружили, что многочисленные стимулы, которые временно увеличивают цитоплазматический Ca 2+ , резко вызывают активацию Aurora-A с чрезвычайно быстрой кинетикой.Ca 2+ -индуцированная активность Aurora-A достигает пика в течение 1 минуты после стимуляции, возвращается к исходному уровню в течение 5 минут, происходит в интерфазных клетках и не связана с деградацией Aurora-A. Активация Aurora-A зависит от прямого взаимодействия между N-концевым доменом Aurora-A с Ca 2+ /CaM, что приводит к аутофосфорилированию Aurora-A на S51, S66 и S98 [46] (46). Фосфорилирование S51/S53, впервые описанное в митотических клетках [48], предполагает, что CaM также может иметь отношение к митотической активации киназы [46].Целевые мутации или препараты, нарушающие связывание Aurora-A с Ca 2+ /CaM, ингибировали активацию Aurora-A не только при резорбции ресничек, но и в митозе, было показано, что CaM ко-локализуется с Aurora-A на протяжении всего митоза [45], Было показано, что хелатирование кальция снижает не только взаимодействия CaM-Aurora-A, но и взаимодействие Aurora-A NEDD9. Эти данные подразумевают, что на активность Aurora-A может сложным образом влиять медикаментозное лечение, влияющее на передачу сигналов кальция, и что эти изменения активности не будут отражаться при измерении фосфорилирования T288.Кроме того, Aurora-A непосредственно фосфорилирует и отрицательно регулирует активность кальциевого канала PKD2, ассоциированного с ресничками. Это обеспечивает интересную связь между функцией Aurora-A и патологией PKD, которая может иметь отношение к клиническому применению ингибиторов Aurora-A [87].

А . Взаимодействие Aurora-A с Ca 2+ /кальмодулином (CaM) приводит к аутофосфорилированию Aurora-A на S51, S66 и S98; дополнительное взаимодействие с NEDD9 приводит к аутофосфорилированию Aurora-A на T288.Фосфорилированная Аврора-А способствует резорбции ресничек. Б . Атипичная протеинкиназа C (aPKC) фосфорилирует Aurora-A в точке T287, индуцируя аутофосфорилирование Aurora-A в точке T288, что облегчает связывание между Aurora-A и TPX2. Aurora-A, связанная с TPX2, фосфорилирует NDEL1 по остатку S251. Активный NDEL1 регулирует расширение нейритов.

Aurora-A, TPX2 и два дополнительных партнера по связыванию — атипичная протеинкиназа C (aPKC) и NDEL1 — имеют решающее значение для регуляции организации нейронных микротрубочек и ремоделирования цитоскелета во время удлинения нейритов [28, 94] ().aPKC фосфорилирует Aurora-A в точке T287, индуцируя аутофосфорилирование Aurora-A в точке T288, что облегчает связывание между Aurora-A и TPX2. Aurora-A, связанная с TPX2, впоследствии фосфорилирует NDEL1. Активные формы Aurora-A, TPX2 и NDEL1 совместно локализуются и ко-иммунопреципитируют in vitro . Важно отметить, что фосфорилированные локализации Aurora-A и NDEL1 перекрываются в области, окружающей центросому, что позже может определять полярность нейронов. Подавление aPKC, Aurora-A или TPX2 или разрушение NDEL1 приводит к значительному снижению частоты эманации микротрубочек из центра организации микротрубочек нейронов и серьезному нарушению удлинения нейритов [28, 94].Кроме того, потенциальное взаимодействие между Aurora-A, aPKC и другими ключевыми центросомными белками может опосредовать динамику микротрубочек, определяющую клеточную полярность в нейроне [95]. Таким образом, активация Aurora-A определяет нормальную постмитотическую дифференцировку нейронов. Степень, в которой ингибиторы Aurora-A действуют на ткани головного мозга по сравнению с опухолями головного мозга, в настоящее время неизвестна; равно как и потенциальная роль контроля фосфорилирования активности Aurora-A через S342, S98 или др. неканонические сайты в интерфазных контекстах.

7. Экспертное заключение

Ингибиторы Aurora-A рассматривались как новый класс антимитотических агентов, потенциально более активных и менее токсичных, чем химиотерапевтические митотические ингибиторы. В проведенных на сегодняшний день испытаниях алисертиб продемонстрировал некоторую эффективность, особенно при гематологических злокачественных новообразованиях по сравнению с солидными опухолями, а также некоторые преимущества у пациентов, ранее получавших лечение. Для повышения эффективности алисертиба изучаются комбинированные подходы с химиотерапией или другими таргетными препаратами. В целом, ингибиторы Aurora-A остаются многообещающими, но еще не оптимизированы клинически.Идентификация множественных интерфазных условий, в которых Aurora-A активируется и играет функциональную роль, обеспечила одну форму сложности в оценке молекулярной и клинической активности Aurora-A.

Чтобы понять реакцию клеток и опухолей на алисертиб, важно уметь соотносить ингибирование роста с ингибированием ферментативной мишени. Было проведено множество доклинических и клинических исследований активации Aurora-A с участием многих типов тканей (например, [100–119]). Как правило, в доклинических исследованиях активность ингибиторов Аврора-А оценивали с помощью антител к эпитопу фосфо-Т288.В нескольких исследованиях учитывался уровень общего Aurora-A, чтобы доказать, что снижение фосфорилирования T288 было связано с ингибированием фосфорилирования, а не с деградацией или подавлением Aurora A. Подходы золотого стандарта, в том числе использование масс-спектрометрии с иммунопреципитированным Aurora-A для полной оценки профиля фосфорилирования или оценка активности иммунопреципитированного Aurora-A в отношении нескольких субстратов с помощью анализа киназы in vitro, не использовались. Хотя в небольшом количестве исследований изучалась экспрессия NEDD9 или p53 или связанных с раком белков ниже по течению от Aurora-A, экспрессия партнеров Aurora-A, которые, как известно, регулируют активность белка, обычно не изучалась.В клинических исследованиях биологический эффект алисертиба обычно оценивали с использованием маркеров клеточной пролиферации, таких как митотический индекс, в образцах опухолей или биоптатах кожи. В то время как общие уровни Aurora-A измеряли с помощью иммуногистохимии или оценки амплификации гена, прямая оценка того, насколько хорошо алисертиб ингибирует киназную активность Aurora-A, путем измерения фосфорилирования Aurora-A или активности киназы, как правило, не проводилась. Точно так же экспрессия партнеров Aurora-A почти никогда не оценивается в клинических образцах.Очевидно, что получение такой информации может значительно пролить свет на профиль ответа у людей, получавших алисертиб или другие ингибиторы Aurora-A.

Поскольку клиническая разработка ингибиторов Aurora-A продолжается, в корреляционных исследованиях для испытаний следует принимать во внимание все больше данных, обобщенных выше, которые указывают на многочисленные факторы, способствующие активации Aurora-A. Все ингибиторы Aurora-A, которые в настоящее время проходят клинические испытания, работают, блокируя аутофосфорилирование T288 в петле активации.Сообщалось о том, что Aurora-A имеет несколько других сайтов фосфорилирования, модулирующих ее митотическую и немитотическую активность (остатки S51, S53/S54, S66/S67, S89, S98 и S342), и что альтернативные киназы (например, PAK) для фосфорилирования Aurora-A на T288, вместе предполагают, что необходимо разработать и применить реагенты антител к некоторым из этих дополнительных фосфо-остатков. Возможна также активация Aurora-A без фосфорилирования, когда связывание активирующего партнера Aurora-A TPX-2 изменяет конформацию активного центра Aurora-A, что приводит к киназной активности [42].Следовательно, необходимо приложить некоторые усилия для разработки суррогатных киназных анализов, измеряющих фосфорилирование других белков, зависящих от активной Aurora-A. Другие биомаркеры могут отражать стабильность нижестоящих факторов, зависящих от фосфорилирования Aurora-A. Например, в мышиных моделях нейробластомы, вызванной амплификации N-Myc, алисертиб разрушал комплекс Aurora-A/N-Myc и способствовал деградации N-Myc; это, в свою очередь, ингибировало N-Myc-зависимую транскрипцию, коррелируя с регрессией опухоли и продолжительным выживанием.Амплификация онкогена N-Myc обычно вызывает нейроэндокринные опухоли, такие как нейробластома, мелкоклеточная карцинома легкого и нейроэндокринный рак предстательной железы. Поскольку целевые ингибиторы для N-Myc не существуют, дестабилизация N-Myc путем нацеливания на Aurora-A может быть как потенциально ценной с терапевтической точки зрения, так и служить косвенным показателем ингибирования киназы [117].

Жесткий пространственный и временной контроль активации Aurora-A в нормальных клетках включает множество белков-партнеров, обсуждавшихся выше [33, 35, 42, 47, 54-59, 73].Уже было показано, что экспрессия TPX2 и NEDD9 влияет на стабильность киназы Aurora-A и биологическую активность ингибиторов киназы Aurora-A. Очевидно, что эти и другие белки, регулирующие активацию Aurora-A, являются отличными кандидатами в качестве биомаркеров, которые могут быть в состоянии стратифицировать пациентов для вероятного ответа на агенты, направленные на Aurora-A. Однако из-за сложности контроля регуляции Aurora-A идентификация биомаркеров может быть затруднена. Например, в моделях ХМЛ и ОЛЛ, положительного по филадельфийской хромосоме, алисертиб проявлял цитотоксические эффекты независимо от статуса р53, вопреки ожиданиям [118].Тем не менее, результаты испытаний подчеркивают необходимость разработки биомаркеров. Например, алисертиб обладает значительной активностью у небольшой подгруппы (10%) пациентов с резистентным к препаратам платины раком яичников, что приводит к стойкому частичному ответу, продолжающемуся от полугода до почти года. Это клинически значимый результат для очень резистентной к лечению популяции пациентов; биомаркер явно необходим для выявления тех пациентов, которые ответят на лечение. Одной из возможностей является разработка количественной ОТ-ПЦР или иммуногистохимического анализа на основе микрочипа опухолевой ткани для отслеживания экспрессии или активности взаимодействующих партнеров Aurora-A, таких как NEDD9, PAK1, TPX2 и другие.Некоторые из белков-партнеров Aurora-A могут подходить в качестве мишеней для совместного ингибирования с Aurora-A. Например, киназы PAK в настоящее время являются активными мишенями для разработки ингибиторов с некоторыми многообещающими результатами доклинических испытаний [72]; комбинация ингибиторов PAK с алисертибом представляет значительный интерес. Если из области системной биологии и можно извлечь один последовательный урок, то он заключается в том, что ингибирование одной мишени, каким бы многообещающим оно ни было, вероятно, будет недостаточным для лечения рака, за исключением самых необычных случаев.Понимание сложности регуляции и функции Aurora-A необходимо для разработки новых и эффективных целевых методов лечения и терапевтических комбинаций. Безусловно, знание структурной и молекулярной биологии может ускорить клиническую разработку.

Поле с описанием статьи

  • Многие ценные клинические мишени представляют собой киназы. Надежная способность отбирать пациентов для использования препаратов, ингибирующих киназу, и оценивать активность ингибиторов киназы у пациентов имеет важное значение для оптимальной клинической эффективности этих препаратов.

  • Киназа Aurora-A, необходимая для митоза, является ценной клинической мишенью при раке. Алисертиб и другие ингибиторы Aurora-A, воздействующие на каталитический центр, в настоящее время проходят многочисленные клинические испытания.

  • Как правило, активность Aurora-A оценивают с помощью антител, нацеленных на фосфоэпитоп T288 в петле активации, который автофосфорилируется во многих условиях активации Aurora-A.

  • Растущее число биофизических и биохимических исследований выявило неканонические способы активации Aurora-A, включая аутофосфорилирование в альтернативных сайтах, фосфорилирование другими киназами и аллостерические изменения, обусловленные белок-белковыми взаимодействиями.Многие из белков, влияющих на активацию Aurora-A, сами экспрессируются по-разному и активны при раке.

  • Мы представляем обзор последствий этих недавних открытий для использования и оценки ингибиторов Aurora-A в дальнейшей клинической разработке.

Благодарности

Авторы получили поддержку R21CA181287 и R01CA63366 (для EAG), R01 GM084453 (для RLD) и P30 CA006927 (для онкологического центра Fox Chase). Мы благодарим Илью Серебрийского за ценные комментарии к статье.

Сокращения СаМих разрушение коробки
FFPE фиксированного формалин, парафин
CDK1 циклин-зависимая киназа 1
СаМих кальмодулин
Са 2+ / Са 2+ -liganded кальмодулин
Limk1 LIM домен киназы 1
РР1 протеина фосфатазы 1
РР6 белка фосфатазы 6
APC / C анафазу -promoting комплекс / cyclosome
D-бокс
ПКД поликистоз почек
aPKC атипичные протеинкиназы С
ВСЕ острый лимфобластный лейкоз
ХМЛ хронический миелогенный лейкоз
МП M-2 моноклональный митотический белок #2
PHh4 фосфогистон h4

Ссылки

1.Вайнштейн ИБ. Рак. Зависимость от онкогенов — ахиллесово лекарство от рака. 2002; 297: 63–4. [PubMed] [Google Scholar]**3. Меральди П., Хонда Р., Нигг Э.А. Сверхэкспрессия Aurora-A показывает тетраплоидизацию как основной путь к амплификации центросом в клетках p53-/-. EMBO J. 2002; 21: 483–92. Механистическое объяснение активности Aurora-A в продвижении геномной нестабильности. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]**4. Ананд С., Пенрин-Лоу С., Венкитараман А.Р. Амплификация AURORA-A подавляет контрольную точку сборки митотического веретена, вызывая устойчивость к таксолу.Раковая клетка. 2003; 3: 51–62. Ранняя демонстрация взаимосвязи экспрессии Aurora-A и реакции на лекарство. [PubMed] [Google Scholar]5. Вейдер Г., Ленс С.М. Семейство киназ Aurora в делении клеток и раке. Биохим Биофиз Акта. 2008; 1786: 60–72. [PubMed] [Google Scholar]6. Чжан Д., Хирота Т., Марумото Т. и др. Cre-loxP-контролируемая периодическая сверхэкспрессия Aurora-A вызывает митотические аномалии и гиперплазию в молочных железах моделей мышей. Онкоген. 2004; 23:8720–30. [PubMed] [Google Scholar]7.Тацука М., Катаяма Х., Ота Т. и др. Многоядерность и повышенная плоидность, вызванная сверхэкспрессией митотической протеинкиназы, ассоциированной с аврора- и Ipl1-подобной серединой тела, в раковых клетках человека. Рак рез. 1998; 58:4811–6. [PubMed] [Google Scholar]8. Никонова А.С., Асцатуров И.Г., Серебрийский И.Г., и др. Киназа Aurora A (AURKA) в нормальном и патологическом делении клеток. Cell Mol Life Sci. 2013;70:661–87. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Аньезе В., Базан В., Фиорентино Ф.П. и др. Роль ингибиторов Аврора-А в терапии рака.Энн Онкол. 2007; 18 (Приложение 6): 47–52. [PubMed] [Google Scholar] 10. Надлер Ю., Кэмп Р.Л., Шварц С. и др. Экспрессия Aurora A (но не Aurora B) позволяет прогнозировать выживаемость при раке молочной железы. Клин Рак Рез. 2008; 14:4455–62. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]11. Ратушный В., Патхак Х.Б., Бихарри Н. и др. Двойное ингибирование киназ SRC и Aurora вызывает постмитотические дефекты прикрепления и гибель клеток. Онкоген. 2012;31:1217–27. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]12. Отто Т., Хорн С., Брокманн М. и др.Стабилизация N-Myc является важной функцией Aurora A при нейробластоме человека. Раковая клетка. 2009; 15:67–78. [PubMed] [Google Scholar] 13. Лю К., Канеко С., Ян Л. и др. Отмена Aurora-A связывания ДНК p53 и активности трансактивации путем фосфорилирования серина 215. J Biol Chem. 2004; 279:52175–82. [PubMed] [Google Scholar] 14. Wu CC, Yang TY, Yu CT, et al. p53 негативно регулирует Aurora A посредством как транскрипционной, так и посттрансляционной регуляции. Клеточный цикл. 2012;11:3433–42. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]15.де Карсер Г., Малумбрес М. Центросомный путь нестабильности генома рака. Nat Cell Biol. 2014;16:504–6. [PubMed] [Google Scholar] 16. Friedberg JW, Mahadevan D, Cebula E, et al. Исследование фазы II алисертиба, селективного ингибитора киназы Aurora A, при рецидивирующих и рефрактерных агрессивных B- и T-клеточных неходжкинских лимфомах. Дж. Клин Онкол. 2014; 32:44–50. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]17. Матулонис У.А., Шарма С., Гаманде С. и др. Исследование фазы II MLN8237 (алисертиб), исследуемого ингибитора киназы Aurora A, у пациентов с резистентной или рефрактерной к платине эпителиальной карциномой яичников, фаллопиевых труб или первичной карциномой брюшины.Гинекол Онкол. 2012; 127:63–9. [PubMed] [Google Scholar] 18. Абэ Ю., Осуги М., Харагучи К. и др. Комплекс LATS2-Ajuba регулирует рекрутирование гамма-тубулина в центросомы и организацию веретена во время митоза. ФЭБС лат. 2006; 580: 782–8. [PubMed] [Google Scholar] 19. Мори Д., Яно Ю., Тойо-ока К. и др. Фосфорилирование NDEL1 с помощью киназы Aurora-A необходимо для центросомного созревания, разделения и рекрутирования TACC3. Мол Селл Биол. 2007; 27: 352–67. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]20. Медсестра П.Универсальный механизм управления, регулирующий наступление М-фазы. Природа. 1990; 344: 503–8. [PubMed] [Google Scholar] 21. Дутертре С., Казалес М., Куаранта М. и др. Фосфорилирование CDC25B с помощью Aurora-A в центросоме способствует переходу G2-M. Дж. Клеточные науки. 2004; 117: 2523–31. [PubMed] [Google Scholar] 23. Оучи М., Фудзиучи Н., Сасаи К. и др. Фосфорилирование BRCA1 с помощью Aurora-A в регуляции перехода G2 в M. Дж. Биол. Хим. 2004; 279:19643–8. [PubMed] [Google Scholar] 25. Флойд С., Пайнс Дж., Линдон С.APC/C Cdh2 нацелен на киназу aurora, чтобы контролировать реорганизацию митотического веретена в анафазе. Карр Биол. 2008; 18:1649–58. [PubMed] [Google Scholar] 26. Перес де Кастро И., Агирре-Портолес С., Мартин Б. и др. Мотив SUMOylation в Aurora-A: значение для динамики веретена и онкогенеза. Фронт Онкол. 2011; 1:50. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]**27. Литтлпейдж Л.Е., Ву Х., Андрессон Т. и др. Выявление фосфорилированных остатков, влияющих на активность митотической киназы Аврора-А.Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99:15440–5. Важное исследование регуляторных сайтов фосфорилирования на Aurora-A. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]*28. Мори Д., Ямада М., Мимори-Кийосуэ Ю. и др. Существенная роль пути aPKC-Aurora A-NDEL1 в удлинении нейритов путем модуляции динамики микротрубочек. Nat Cell Biol. 2009; 11:1057–68. Идентификация активации Aurora-A в постмитотических условиях. [PubMed] [Google Scholar] 29. Диас Б., Барнард Д., Филсон А. и др. Фосфорилирование Raf-1 серин 338-серин 339 является важным регуляторным событием для Ras-зависимой активации и биологической передачи сигналов.Мол Селл Биол. 1997; 17:4509–16. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]30. Роуэн Ф.К., Ричардс М., Бибби Р.А. и др. Взгляд на активацию киназы Aurora-A с использованием неприродных аминокислот, включенных путем химической модификации. ACS Chem Biol. 2013;8:2184–91. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]*31. Додсон К.А., Космопулу М., Ричардс М.В. и соавт. Кристаллическая структура мутанта Aurora-A, который имитирует Aurora-B, связанный с MLN8054: понимание селективности и дизайна лекарств. Биохим Дж. 2010; 427:19–28.Структурный анализ специфичности связывания лекарственных средств с ингибиторами киназы Aurora-A. [PubMed] [Google Scholar] 32. Зорба А., Буози В., Каттер С. и др. Молекулярный механизм автофосфорилирования киназы Aurora A и ее аллостерической активации с помощью TPX2. Элиф. 2014;3:e02667. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]**33. Бейлисс Р., Сардон Т., Вернос И., Конти Э. Структурная основа активации Aurora-A с помощью TPX2 в митотическом веретене. Мол Ячейка. 2003; 12:851–62. Структурное понимание активации Aurora-A одним из его наиболее важных активаторов.[PubMed] [Google Scholar] 34. Чжао Б., Смоллвуд А., Ян Дж. и др. Модуляция взаимодействий киназы-ингибитора путем связывания вспомогательного белка: кристаллографические исследования взаимодействий Aurora A с VX-680 и с TPX2. Белковая наука. 2008; 17:1791–7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]35. Кларк М.А., Ачарья Р.А., Арико-Мюндель К.С. и соавт. Дизайн, синтез и отбор низкомолекулярных библиотек, кодируемых ДНК. Nat Chem Biol. 2009; 5: 647–54. [PubMed] [Google Scholar] 36. Бибби Р.А., Тан С., Фейсал А. и др.Ассоциированный с раком мутант aurora A неправильно локализован и неправильно регулируется из-за потери взаимодействия с TPX2. Дж. Биол. Хим. 2009; 284:33177–84. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]*37. Айерс П.А., Эриксон Э., Чен Л.Г., Маллер Дж.Л. Новый механизм активации протеинкиназы Aurora A. Curr Biol. 2003; 13: 691–7. Изучение аллостерической активации Aurora-A с помощью TPX2. [PubMed] [Google Scholar]*38. Цай М.Ю., Визе С., Цао К. и др. Сигнальный путь Ran, опосредованный митотической киназой Aurora A в сборке веретена.Nat Cell Biol. 2003; 5: 242–8. Связь Ran GTPase с контролем активации Aurora-A. [PubMed] [Google Scholar] 39. Айерс П.А., Маллер Дж.Л. Регуляция активации Xenopus Aurora A с помощью TPX2. Дж. Биол. Хим. 2004; 279:9008–15. [PubMed] [Google Scholar]40. Джубеттини М., Астерити И.А., Скрофани Дж. и соавт. Контроль стабильности Aurora-A посредством взаимодействия с TPX2. Дж. Клеточные науки. 2011; 124:113–22. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]41. Куфер Т.А., Силье Х.Х., Корнер Р. и соавт. Человеческий TPX2 необходим для нацеливания киназы Aurora-A на веретено.Джей Селл Биол. 2002; 158: 617–23. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]*42. Dodson CA, Bayliss R. Активация киназы Aurora-A путем связывания и фосфорилирования белкового партнера независимы и синергичны. Дж. Биол. Хим. 2012; 287:1150–7. Механистическая оценка взаимодействия различных механизмов активации Aurora-A. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]45. Плотникова О.В., Никонова А.С., Лоскутов Ю.В. и др. Активация кальмодулином киназы Aurora-A (AURKA) необходима во время разборки ресничек и в митозе.Мол Биол Селл. 2012;23:2658–70. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]**46. Плотникова О.В., Пугачева Е.Н., Данбрэк Р.Л., Големис Э.А. Быстрая кальций-зависимая активация киназы Aurora-A. Нац коммун. 2010;1:64. Идентификация активации Aurora-A кальмодулином в интерфазных клетках. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]**47. Reboutier D, Troadec MB, Cremet JY и др. Нуклеофосмин/В23 активирует Aurora A в центросоме посредством фосфорилирования серина 89. J Cell Biol. 2012; 197:19–26.Идентификация активации Aurora-A нуклеофозмином. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]48. Haydon CE, Eyers PA, Aveline-Wolf LD, et al. Идентификация новых сайтов фосфорилирования на Xenopus laevis Aurora A и анализ обогащения фосфопептидами с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом. Мол клеточная протеомика. 2003;2:1055–67. [PubMed] [Google Scholar]49. Паскрео Г., Делькрос Дж. Г., Морин Н. и др. Фосфорилирование киназы Aurora-A Ser349 необходимо во время созревания ооцитов Xenopus laevis.Дев биол. 2008; 317: 523–30. [PubMed] [Google Scholar]50. Лоуренс Х.Р., Мартин М.П., ​​Луо И. и др. Разработка о-хлорфенилзамещенных пиримидинов в качестве исключительно мощных ингибиторов киназы аврора. J Med Chem. 2012;55:7392–416. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]51. Саркисян М., Мендес Р., Рихтер Дж.Д. Стимуляция прогестероном и инсулином CPEB-зависимого полиаденилирования регулируется Aurora A и киназой-3 гликогенсинтазы. Гены Дев. 2004; 18:48–61. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]52.Кристыняк А., Гарсия-Эчеверрия С., Приджент С., Феррари С. Ингибирование Авроры А в ответ на повреждение ДНК. Онкоген. 2006; 25: 338–48. [PubMed] [Google Scholar]**53. Литтлпейдж Л.Е., Рудерман Дж.В. Идентификация нового домена распознавания APC/C, A-бокса, который необходим для Cdh2-зависимого разрушения киназы Aurora-A во время выхода из митоза. Гены Дев. 2002; 16: 2274–85. Выявление того, что N-концевые сайты фосфорилирования определяют стабильность Aurora-A. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]*54.Пугачева Е.Н., Големис Е.А. Белок фокальной адгезии HEF1 регулирует активацию киназ Aurora-A и Nek2 в центросоме. Nat Cell Biol. 2005; 7: 937–46. Первая идентификация прометастатического фактора HEF1 (NEDD9) как активатора Aurora-A. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]*55. Чжао З.С., Лим Дж.П., Нг Ю.В. и др. Связанная с ЖКТ киназа PAK нацелена на центросому и регулирует Aurora-A. Мол Ячейка. 2005; 20: 237–49. Идентификация киназы Pak как активатора Aurora-A.[PubMed] [Google Scholar]*56. Хирота Т., Кунитоку Н., Сасаяма Т. и др. Aurora-A и взаимодействующий активатор, белок LIM Ajuba, необходимы для митотической фиксации в клетках человека. Клетка. 2003; 114: 585–98. Идентификация каркасного белка Ajuba в качестве активатора Aurora-A. [PubMed] [Google Scholar]*57. Сатиновер Д.Л., Лич К.А., Штукенберг П.Т., Бротиган Д.Л. Активация киназы Aurora-A ингибитором протеинфосфатазы-2, бифункциональным сигнальным белком. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:8625–30.Идентификация PPI-2 как активатора Aurora-A. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]*58. Молли П.Р., Ли Д.К., Багери-Ярманд Р. и др. Arpc1b, центросомный белок, является как активатором, так и субстратом Aurora A. J Cell Biol. 2010; 190:101–14. Идентификация Arpc1b как активатора Aurora-A. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]*59. Хаттерер А., Бердник Д., Виртц-Пейц Ф. и соавт. Митотическая активация киназы Aurora-A требует ее партнера по связыванию Bora. Ячейка Дев. 2006; 11: 147–57.Идентификация Боры как активатора Авроры-А. [PubMed] [Google Scholar]*60. Паскрео Дж., Делкрос Дж. Г., Кремет Дж. Ю. и др. Фосфорилирование маскина с помощью Aurora-A участвует в контроле последовательного синтеза белка во время созревания ооцитов Xenopus laevis. Дж. Биол. Хим. 2005; 280:13415–23. Идентификация TACC3/маскина как активатора Aurora-A. [PubMed] [Google Scholar]61. Слоан Д.А., Трикич М.З., Чу М.Л. и др. Лекарственно-устойчивые мутанты aurora A для проверки клеточной мишени низкомолекулярных ингибиторов киназы MLN8054 и MLN8237.ACS Chem Biol. 2010;5:563–76. [PubMed] [Google Scholar]*62. Жуков В., Де Николо А., Родригес А. и др. Центросомный белок 192 кДа (Cep192) способствует сборке веретена, управляемой центросомой, участвуя в специфичной для органелл активации Aurora A. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107:21022–7. Идентификация Cep192 как активатора Aurora-A. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]64. Дадке Д., Ярник М., Пугачева Е.Н. и соавт. Нарушение регуляции HEF1 нарушает прогрессирование М-фазы, нарушая цикл активации RhoA.Мол Биол Селл. 2006; 17:1204–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]**65. Айс Р.Дж., Маклафлин С.Л., Ливенгуд Р.Х. и др. Истощение NEDD9 дестабилизирует киназу Aurora A и повышает эффективность ингибиторов Aurora A: последствия для лечения метастатических солидных опухолей. Рак рез. 2013;73:3168–80. Определение того, что экспрессия активатора Aurora-A Nedd9 регулирует реакцию на ингибиторы Aurora-A. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]66. Sabino D, Brown NH, Basto R. Drosophila Ajuba не является активатором Aurora-A, но требуется для поддержания Aurora-A в центросоме.Дж. Клеточные науки. 2011; 124:1156–66. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]67. Бай М., Ни Дж., Шен С. и др. Aurora-A kinase-inactive мутанты нарушают взаимодействие с Ajuba и вызывают дефекты в формировании митотического веретена и остановку фазы G2/M в клетках HeLa. BMB Rep. 2014 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]68. Бай М., Ни Дж., Шен С. и др. Два недавно идентифицированных сайта в N-концевом регуляторном домене Aurora-A необходимы для аутоингибирования. Биотехнологическая лат. 2014; 36:1595–604. [PubMed] [Google Scholar]69.Бай М., Ни Дж., Ву Дж. и др. Новый механизм активации киназы Aurora-A Ajuba. Ген. 2014; 543:133–9. [PubMed] [Google Scholar]70. Ричи Л., Оттман Р., Руманос М., Чакрабарти Р. Функциональная кооперация между киназой Aurora A и киназой LIM1: участие в митотическом процессе. Клеточный цикл. 2012; 11: 296–309. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]71. Секи А., Коппингер Дж.А., Джанг С.И. и др. Bora и киназа Aurora совместно активируют киназу Plk1 и контролируют вход в митоз.Наука. 2008; 320:1655–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]72. Раду М., Семенова Г., Кософф Р., Чернофф Дж. Передача сигналов PAK при развитии и прогрессировании рака. Нат Рев Рак. 2014; 14:13–25. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]*73. Катаяма Х., Чжоу Х., Ли К. и др. Взаимодействие и регуляция обратной связи между киназой STK15/BTAK/Aurora-A и протеинфосфатазой 1 в цикле митотического деления клеток. Дж. Биол. Хим. 2001; 276:46219–24. Идентификация PP1 как ингибитора Aurora-A.[PubMed] [Google Scholar]74. Зенг К., Бастос Р.Н., Барр Ф.А., Грюнеберг У. Протеиновая фосфатаза 6 регулирует формирование митотического веретена, контролируя состояние фосфорилирования Т-петли Aurora A, связанной с ее активатором TPX2. Джей Селл Биол. 2010;191:1315–32. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]75. Чен С.С., Чанг П.К., Ченг Ю.В. и др. Для подавления онкогенной активности STK15 требуется независимая от трансактивации функция p53. EMBO J. 2002; 21:4491–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]76.Шао С., Ван И, Джин С. и др. Gadd45a взаимодействует с aurora-A и ингибирует его киназную активность. Дж. Биол. Хим. 2006; 281:28943–50. [PubMed] [Академия Google]*77. Castro A, Arlot-Bonnemains Y, Vigneron S, et al. APC/Fizzy-Related нацеливается на киназу Aurora-A для протеолиза. EMBO Rep. 2002; 3: 457–62. Идентификация APC как основного агента, нацеленного на уничтожение «Авроры-А». [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]78. Крейн Р., Клёпфер А., Рудерман Дж.В. Требования по уничтожению человека Аврора-А.Дж. Клеточные науки. 2004; 117:5975–83. [PubMed] [Google Scholar]79. Yu X, Minter-Dykhouse K, Malureanu L, et al. Chfr необходим для подавления опухоли и регуляции Aurora A. Нат Жене. 2005; 37: 401–6. [PubMed] [Google Scholar]80. Ши Ю., Соломон Л.Р., Переда-Лопес А. и др. Убиквитин-специфическая цистеиновая протеаза 2а (USP2a) регулирует стабильность Aurora-A. Дж. Биол. Хим. 2011; 286:38960–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]81. Хуан YH, Ву CC, Чжоу CK, Хуан CY. Регулятор трансляции, PUM2, способствует как стабильности белка, так и киназной активности Aurora-A.ПЛОС Один. 2011;6:e19718. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]82. Джонсон Э.О., Чанг К.Х., Гош С. и др. LIMK2 является важным регулятором и эффектором злокачественных новообразований, опосредованных Aurora-A-киназой. Дж. Клеточные науки. 2012; 125:1204–16. [PubMed] [Google Scholar]83. Джонсон Э.О., Чанг К.Х., де Пабло Ю. и др. PHLDA1 является важным негативным регулятором и эффектором киназы Aurora A при раке молочной железы. Дж. Клеточные науки. 2011;124:2711–22. [PubMed] [Google Scholar]84. Чжэн М., МакКаун-Лонго П.Дж. Клеточная адгезия регулирует фосфорилирование Ser/Thr и протеасомную деградацию HEF1.Дж. Клеточные науки. 2006; 119: 96–103. [PubMed] [Академия Google]*85. Чоудхури А., Чоудхури С., Цай М.Ю. Новый ингибитор киназы A Aurora MK-8745 предсказывает TPX2 как терапевтический биомаркер в клеточных линиях неходжкинской лимфомы. Лейк-лимфома. 2012;53:462–71. Идентификация экспрессии TPX2 как регулятора клинического ответа на ингибиторы Aurora-A. [PubMed] [Google Scholar]86. Пугачева Е.Н., Яблонский С.А., Хартман Т.Р., и соавт. HEF1-зависимая активация Aurora A вызывает разборку первичной реснички. Клетка. 2007; 129:1351–63.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]87. Плотникова ОВ, Пугачева ЕН, Големис ЕА. Активность киназы Aurora A влияет на передачу сигналов кальция в клетках почек. Джей Селл Биол. 2011; 193:1021–32. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]88. Юань К., Фролова Н., Се Ю. и др. Первичные реснички уменьшаются при раке молочной железы: анализ коллекции клеточных линий и тканей рака молочной железы человека. J Гистохим Цитохим. 2010; 58: 857–70. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]89. Хан Ю.Г., Ким Х.Дж., Длугош А.А. и соавт.Двойная и противоположная роль первичных ресничек в развитии медуллобластомы. Нат Мед. 2009;15:1062–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]90. Шнайдер Л., Клемент К.А., Тейлманн С.К. и соавт. Передача сигналов PDGFR-альфа-альфа регулируется через первичную ресничку в фибробластах. Карр Биол. 2005; 15:1861–6. [PubMed] [Google Scholar]91. Сигер-Нукпеза Т., Литтл Д.Л., Сержанова В., Големис Э.А. Реснички и ассоциированные с ресничками белки при раке. Наркотиков Discov Today Dis Mech. 2013;10:e135–e42. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]93.Джекман М., Линдон С., Нигг Э.А., Пайнс Дж. Активный циклин B1-Cdk1 впервые появляется на центросомах в профазе. Nat Cell Biol. 2003; 5: 143–8. [PubMed] [Google Scholar]94. Ямада М., Хироцунэ С., Уиншоу-Борис А. Существенная роль LIS1, NDEL1 и Aurora-A в формировании полярности и организации микротрубочек во время нейрогенеза. Сотовый Адх Мигр. 2010;4:180–4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]**96. Манфреди М.Г., Экседи Дж.А., Чакраварти А. и соавт. Характеристика алисертиба (MLN8237), исследуемого низкомолекулярного ингибитора киназы aurora A, с использованием новых фармакодинамических анализов in vivo.Клин Рак Рез. 2011;17:7614–24. Характеристика биологической активности ведущего соединения для ингибирования Aurora-A. [PubMed] [Google Scholar]97. Do TV, Xiao F, Bickel LE и др. Aurora kinase A опосредует миграцию и адгезию клеток эпителиального рака яичников. Онкоген. 2014; 33: 539–49. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]98. Чжоу Н., Сингх К., Мир М.С. и др. Исследуемый ингибитор киназы А Aurora MLN8237 индуцирует дефекты жизнеспособности клеток и прогрессирования клеточного цикла в клетках злокачественного рака мочевого пузыря in vitro и in vivo.Клин Рак Рез. 2013;19:1717–28. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]99. Сехдев В., Катша А., Экседи Дж. и др. Комбинация алисертиба, исследуемого ингибитора киназы Aurora A, и доцетаксела способствует гибели клеток и уменьшает рост опухоли в доклинических клеточных моделях аденокарцином верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Рак. 2013;119:904–14. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]100. Сехдев В., Пэн Д., Сутто М. и др. Ингибитор aurora kinase A MLN8237 усиливает индуцированную цисплатином гибель клеток в клетках аденокарциномы пищевода.Мол Рак Тер. 2012; 11: 763–74. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]101. Брюэр Саванна К.Дж., Демикко Э.Г., Лусби К. и др. Двойное нацеливание mTOR и киназы aurora-A для лечения лейомиосаркомы матки. Клин Рак Рез. 2012;18:4633–45. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]102. Кэрол Х., Бём И., Рейнольдс С.П. и др. Эффективность и фармакокинетическая/фармакодинамическая оценка ингибитора киназы А Aurora MLN8237 в отношении доклинических моделей рака у детей. Рак Chemother Pharmacol.2011;68:1291–304. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]103. Патель А.В., Ивз Д., Джессен В.Дж. и др. Ras-управляемый анализ транскриптома идентифицирует киназу aurora A как потенциальную терапевтическую мишень злокачественной опухоли оболочки периферического нерва. Клин Рак Рез. 2012;18:5020–30. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]104. Мускал Дж.А., Скорсоне К.А., Чжан Л. и др. Аддитивные эффекты вориностата и MLN8237 в клеточных линиях детской лейкемии, медуллобластомы и нейробластомы. Инвестируйте в новые лекарства. 2013; 31:39–45.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]105. Горгун Г., Калабрезе Э., Хидешима Т. и др. Новый ингибитор киназы Aurora-A MLN8237 вызывает цитотоксичность и остановку клеточного цикла при множественной миеломе. Кровь. 2010; 115:5202–13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]106. Махадеван Д., Стейскал А., Кук Л.С. и соавт. Ингибитор Aurora A (MLN8237) в сочетании с винкристином и ритуксимабом является синтетическим летальным и потенциальным лечебным средством при агрессивной В-клеточной неходжкинской лимфоме. Клин Рак Рез. 2012;18:2210–9.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]107. Ци В., Спир С., Лю С. и др. Алисертиб (MLN8237), исследуемый агент, подавляет активность Aurora A и B, ингибирует пролиферацию, способствует эндоредупликации и индуцирует апоптоз в клеточных линиях Т-НХЛ, подтверждая его важность в лечении ПТКЛ. Лейк Рез. 2013; 37: 434–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]108. Ци В., Кук Л.С., Лю С. и др. Ингибитор Aurora MLN8237 в сочетании с доцетакселом усиливает апоптоз и противоопухолевую активность при мантийноклеточной лимфоме.Биохим Фармакол. 2011; 81: 881–90. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]109. Томита М., Мори Н. Аврора Селективный ингибитор MLN8237 подавляет рост и выживание Т-клеток, инфицированных HTLV-1, in vitro. Онкологические науки. 2010; 101:1204–11. [PubMed] [Google Scholar] 110. Келли КРСР, Махалингам Д. и др. Новый перорально активный ингибитор киназы aurora A MLN8237 обладает высокой активностью в доклинических моделях острого миелоидного лейкоза и значительно повышает эффективность цитарабина. Кровь (тезисы ежегодного собрания ASH) 2009; 114: резюме 2087.[Google Академия] 111. Келли К.Р., Экседи Дж., Медина Э. и др. Новый ингибитор киназы Aurora A MLN8237 активен при резистентном хроническом миелоидном лейкозе и значительно повышает эффективность нилотиниба. J Cell Mol Med. 2011;15:2057–70. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]112. Инфанте Дж.Д.Э., Коэн Р.Б. и соавт. Фаза I исследования безопасности, фармакокинетики (ФК) и фармакодинамики (ФД) MLN8237, селективного ингибитора киназы аврора А, в США. Eur J Cancer Suppl. 2008; 6:90.(абстр. 280) [Google Scholar] 113. Dees EC, Cohen RB, von Mehren M, et al. Фаза I исследования ингибитора киназы aurora A MLN8237 при распространенных солидных опухолях: безопасность, фармакокинетика, фармакодинамика и биодоступность двух пероральных препаратов. Клин Рак Рез. 2012;18:4775–84. [PubMed] [Google Scholar] 114. Сервантес А., Элез Э., Рода Д. и др. Фаза I фармакокинетического/фармакодинамического исследования MLN8237, исследуемого перорального селективного ингибитора киназы аврора, у пациентов с солидными опухолями на поздних стадиях.Клин Рак Рез. 2012;18:4764–74. [PubMed] [Google Scholar] 115. Сервантес-Руиперес Б.Х., Коэн Р.Б. и соавт. Фармакокинетические и фармакодинамические результаты двух исследований фазы I исследуемого селективного ингибитора киназы aurora A (AAK) MLN8237: зависимое от воздействия ингибирование AAK в опухолях человека. Дж. Клин Онкол. 2010;28(прил.):абстр. 3031. [Google Scholar]116. Келли К.Р., Ши Т.К., Гой А. и др. Фаза I исследования MLN8237 — исследуемого ингибитора киназы Aurora A — при рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломе, неходжкинской лимфоме и хроническом лимфоцитарном лейкозе.Инвестируйте в новые лекарства. 2013 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]117. Брокманн М., Пун Э., Берри Т. и др. Низкомолекулярные ингибиторы aurora-a индуцируют протеасомную деградацию N-myc при нейробластоме у детей. Раковая клетка. 2013; 24:75–89. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]118. Zhang MHJ, Sells T, et al. In vivo характеристика ингибитора киназы aurora A MLN8237 в подкожных и диссеминированных моделях рака человека. Proc Am Assoc Cancer Res. 2009;49:abstr 5646. [Google Scholar]119.Алиагас-Мартин И., Бердик Д., Корсон Л. и др. Класс 2,4-бисанилинопиримидиновых ингибиторов Aurora A с необычно высокой селективностью против Aurora B. J Med Chem. 2009;52:3300–7. [PubMed] [Google Scholar]

Фосфорилирование Bora заменяет в транс фосфорилирование Т-петли в Aurora A, чтобы способствовать вступлению в митоз

KD Plk1 является достаточным субстратом для потенцированного pBora фосфорилирования с помощью AURKA

В предыдущих работах было установлено, что аминоконец фрагмента Bora (остатки 1–224) достаточно для стимуляции фосфорилирования Plk1 в критическом регуляторном сайте T-петли T210 (далее фосфорилирование Plk1) с помощью AURKA in vitro 25 и в экстрактах яиц Xenopus 27 .Чтобы исследовать минимальные детерминанты этого события фосфорилирования, мы восстановили реакцию in vitro с использованием очищенных компонентов (рис. 1a, b). Как показано на рис. 1c, в отсутствие Bora фосфорилирование Plk1 не наблюдалось (дорожки 3, 8 и 13). Однако при добавлении Bora 1–224 было обнаружено слабое фосфорилирование Plk1 (дорожки 2, 7 и 12), которое могло быть значительно усилено предварительным фосфорилированием Bora 1–224 с помощью CyclinA2-Cdk2 (дорожки 1). , 6 и 11), в соответствии с предыдущим отчетом 25 .Делеция PBD Plk1 (∆PBD) (дорожки 6–10) или как PBD, так и междоменного линкера (т. е. конструкции, состоящей только из киназного домена (KD)) (дорожки 11–15), не влияла на фосфорилирование Plk1 с помощью AURKA указывает, что критические детерминанты для эффективного фосфорилирования Plk1 лежат в пределах KD Plk1. Сходным образом, каталитически неактивный мутант (K82R) Plk1 KD также эффективно фосфорилировался с помощью AURKA, исключая роль аутопрайминга с помощью Plk1 в этом процессе. Более того, удаляя AURKA из реакции, мы исключили прямую роль Cyclin-Cdk в фосфорилировании Т-петли Plk1 (дорожки 5, 10, 15).Эти результаты показывают, что KD Plk1 является минимальным субстратом для фосфорилирования Т-петли с помощью AURKA в присутствии фосфорилированного Bora.

Bora представляет собой внутренне неупорядоченный белок, который напрямую связывается с AURKA

Затем мы исследовали свойства связывания Bora с AURKA и Plk1 KD. С этой целью мы использовали анализ ядерного магнитного резонанса (ЯМР) гетероядерной одиночной квантовой когерентности (HSQC) с 15 N, меченным изотопом Bora 1–224 . Первоначальный анализ HSQC нефосфорилированного 15 N-Bora 1–224 в отдельности выявил закономерность, указывающую на внутренне неупорядоченный белок (дополнительная рис.2а, левая панель). В частности, все резонансные пики сгруппированы между 8,5 и 7,5 ppm на оси 1 H. Такая узкая дисперсия отражает схожую среду, отобранную остатками в неупорядоченном состоянии, по сравнению с большим разнообразием сред, отобранных остатками в свернутом состоянии. Фосфорилирование Bora 1–224 с помощью Cyclin-Cdk в среднем от 8 до 10 сайтов S / TP (дополнительный рисунок 2a, правая панель) привело к ожидаемому сдвигу резонансных пиков в слабое поле, соответствующих фосфорилированным аминокислотам.Большинство резонансных пиков оставались сгруппированными между 8,5 и 7,5 м.д. на оси 1 H, что позволяет предположить, что фосфорилирование Bora не вызывает перехода к упорядоченной третичной структуре. Добавление немеченого Plk1 KD к нефосфорилированному Bora 1–224 или к циклин-Cdk-фосфорилированному Bora 1–224 выявило небольшой сдвиг пика или уширение линии (рис. 2a, b, левые панели соответственно). В отличие от этого, добавление немеченого AURKA вызвало резкое изменение высоты резонансного пика, включая исчезновение пика в обоих условиях, что явно указывает на прямое связывание (рис.2а, б, правые панели).

Рис. 2: Bora представляет собой внутренне неупорядоченный белок, который связывается с AURKA.

a ЯМР-анализ связывающего взаимодействия между нефосфорилированным 15 N-меченым Bora ( 15 N-Bora) и немечеными AURKA и Plk1. Слева наложены спектры 1 H- 15 N HSQC 15 N-Bora в чистом черном цвете с 15 N-Bora в красном в присутствии двух мольных эквивалентов [1:2] Plk1 KD . Справа: 15 N-бора в чистом виде черного цвета с 15 N-бора синим цветом в присутствии двух мольных эквивалентов [1:2] AURKA. b ЯМР-анализ связывающего взаимодействия между CyclinA2-Cdk2 фосфорилированным 15 N-Bora и немечеными AURKA и Plk1. Слева наложены спектры 1 H- 15 N HSQC фосфорилированного 15 N-бора в чистом черном цвете с фосфорилированным 15 N-бора красным в присутствии двух мольных эквивалентов [1:2] Plk1 КД. Справа фосфорилированный 15 N-бора в отдельности черным цветом с фосфорилированным 15 N-бора синим цветом в присутствии двух мольных эквивалентов [1:2] AURKA. c Эксперименты Pull-down между иммобилизованным биотинилированным AVI-меченым Bora 1–224 (bAVI-Bora 1–224 ) или биотинилированным AVI-меченым pBora 1–224 и AURKA (левая панель), Plk1 KD ( средняя панель) или смесь AURKA и Plk1 KD (правая панель). d , e SPR-анализ связывания иммобилизованного Bora 1–224 ( d ) и pBora 1–224 ( e ) с AURKA

3 WT 90. K d значения представляют средние значения, n  = 2.Показанные репрезентативные профили взяты из одного эксперимента. См. Дополнительный рисунок 2d, e, соответственно, для следов сенсограммы.

В соответствии с нашими наблюдениями ЯМР, функциональная AVI-меченая Bora 1–224 (дополнительная рис. 2b, c) как в нефосфорилированном, так и в циклинA2-Cdk2-фосфорилированном состоянии, сильно сдвинута вниз AURKA (рис. 2c, левая панель) ), но не Plk1 KD (рис. 2c, центральная панель). Это открытие согласуется с предыдущими наблюдениями, показывающими, что Bora не ко-иммунопреципитирует с Plk1 KD в клетках человека 31 .Кроме того, добавление AURKA к реакции связывания Plk1 KD не способствовало связыванию Plk1 KD с Bora 1–224 (рис. 2c, правая панель).

Для дальнейшего изучения связи между Bora 1–224 и AURKA мы использовали поверхностный плазмонный резонанс (SPR). AURKA, связанный с биотинилированным Bora 1–224 и биотинилированным pBora 1–224 , иммобилизованным на сенсорном чипе, со значениями K d ~ 52 мкМ и ~ 18 мкМ соответственно (рис. 2d, e и дополнительный рисунок). .2г, д; см. также Дополнительную таблицу 1 для количественных значений, описанных в этой рукописи). Вместе наши исследования связывания ЯМР, пулл-даун и ППР показали, что Bora 1–224 может напрямую связываться с KD AURKA, а не с KD Plk1. Кроме того, фосфорилирование Bora 1–224 с помощью Cyclin-Cdk, по-видимому, увеличивает его сродство к AURKA в некоторой степени (более чем в 2,5 раза). Эти наблюдения поддерживают модель, в которой pBora 1–224 способствует фосфорилированию Т-петли Plk1 частично путем прямого связывания с AURKA.

pBora может активировать AURKA без фосфорилирования Т-петли

Автофосфорилирование остатка Т-петли Thr288 (соответствует T295 у Xenopus AURKA, дополнительная рис. 1) необходимо для каталитической активации AURKA 43,44 . Действительно, подобно каталитически мертвому мутанту AURKA D274N , дефосфо-AURKA WT и мутанту AURKA T288V , у которых отсутствует фосфорилирование Т-петли (дополнительный рисунок 3a), не было каталитической активности по отношению к Plk1 KD . K82R даже в присутствии Bora 1–224 (рис.3а, б (ср. дорожку 2 с 5, 8 и 11). Аналогичным образом, в отличие от AURKA WT , мутант AURKA T288V не мог фосфорилировать Bora 1–224 (рис. 3b, сравните электрофоретический сдвиг Bora 1–224 на дорожках 2 и 5 на этапе 2). . Поразительно, но в присутствии pBora 1–224 как AURKA T288V , так и дефосфо-AURKA WT , но не каталитически мертвый мутант AURKA D274N , проявляли устойчивую активность против Plk1 KD

K8.3b, сравните дорожки 1, 4, 7 и 10). Эта потенцирующая активность Bora в отношении AURKA T288V полностью зависела от активности CyclinA2-Cdk2, поскольку Bora 1–224 , фосфорилированный исключительно AURKA (дорожка 6), не стимулировал активность AURKA в отношении Plk1 (дополнительный рисунок 3b). Таким образом, присутствие фосфатов на консенсусных сайтах Cyclin-Cdk S/T-P у Bora, по-видимому, компенсирует отсутствие существенного фосфорилирования Т-петли T288 у AURKA.

Рис. 3: фосфо-бора активирует дефосфо-AURKA и ее аналог AURKA T288V .

a Двухэтапное восстановление in vitro фосфорилирования T-петли на T210 Plk1 KD (pT210) с помощью AURKA WT, мутанта AURKA T-петли (T288V), дефосфорилированного AURKA (WT dephos ) или каталитически мертвого AURKA Мутант D274N и активатор Bora 1–224 . На этапе 1 Bora фосфорилируется (+) или нет (-) киназой CyclinA2-Cdk2. На этапе 2 фосфорилированный Bora 1–224 из реакционной смеси на этапе 1 инкубируют с AURKA (в указанных формах) и киназным доменом KD каталитически мертвого Plk1 K82R . b Вестерн-блот анализ киназных реакций, проведенных с Bora 1–224 , фосфорилированным (+) или не (–) циклином A2-Cdk2 (стадия 1) в присутствии Plk1 K82R KD и указанных форм AURKA , а именно фосфорилированный WT, дефосфорилированный WT, мутант T288V или мутант D274N (шаг 2). Блоты зондировали антителами к Bora, AURKA и фосфоТ210 Plk1 или pan Plk1, как указано (сверху вниз). В блоте, проведенном с антителом анти-pT210 Plk1, звездочка обозначает перекрестную реактивность с остатком pT288 AURKA WT . C , D , D Активация AURKA WT ( C ) или AURKA T288V ( D ) активность киназы Bora 1-224 и Pboara 1-224 Как оценивается с использованием ADP- Анализ Glo и субстрат Kemptide. Отображаемые точки данных и значения EC 50 представляют среднюю люминесценцию для каждого условия реакции со стандартными отклонениями среднего значения в виде планок погрешностей ( n  = 3 независимых образца эксперимента). RLU: относительная световая единица.НД: не определено. Результаты реакции, проведенной в отсутствие кемптида, показаны на дополнительном рисунке 3c, d. e , f SPR-анализ связывания иммобилизованного Bora 1–224 ( e ) и pBora 1–224 ( f ) с AURKA T2328V 9. K d значения представляют средние значения, n  =  2. Показанные репрезентативные профили взяты из одного эксперимента. См. Дополнительный рисунок 3e, f, соответственно, для следов сенсограммы.

Чтобы определить, является ли потенцирующий эффект Bora 1–224 на AURKA специфичным для субстрата, мы протестировали несвязанный субстрат Kemptide, отслеживая активность АТФазы с помощью анализа ADP-Glo, который количественно определяет количество АДФ, продуцируемого во время киназной реакции. AURKA WT в присутствии (рис. 3c) и в отсутствие кемптида (дополнительный рис. 3c) демонстрировал очень низкую базальную АТФазную активность. Титрование Bora или pBora многократно усиливало АТФазную активность AURKA WT .Значение EC 50 для потенцирования было выше для pBora по сравнению с Bora (0,19 ± 0,1 мкМ против 1,2 ± 0,7 мкМ соответственно) (рис. 3c), что согласуется с более плотной аффинностью связывания pBora с AURKA, обнаруженной с помощью SPR (рис. 2г, д).

AURKA T288V продемонстрировал незначительную активность АТФазы отдельно (дополнительный рисунок 3d) или в присутствии субстрата кемптида (рис. 3d), а титрование бора не оказало заметного активирующего эффекта на AURKA T288V . Поразительно, однако, что pBora значительно усиливала АТФазную активность AURKA T288V в обоих условиях (+/- субстрат кемптида) (0.04 ± 0,001 мкМ против 0,02 ± 0,003 мкМ соответственно). Как видно из более низкого значения EC 50 , это потенцирование было даже выше, чем у pBora на AURKA WT (рис. 3c), что предполагает повышенную аффинность связывания pBora с AURKA T288V . Этот вывод был подтвержден SPR, поскольку AURKA T288V связывал pBora более тесно по сравнению с нефосфорилированным Bora ( K d  = 6 против 11  мкМ соответственно) (рис. 3e, f и дополнительный рисунок 3e, f) .Таким образом, фосфат(ы) на боре усиливают аффинность связывания с AURKA WT и AURKA T288V и способствуют более выраженной способности стимулировать активность киназы/АТФазы AURKA.

Чтобы подтвердить эти выводы относительно другого известного субстрата AURKA, мы исследовали фосфорилирование AURKA гистона 3 на Ser10. В соответствии с нашими выводами с использованием Plk1 KD и кемптида в качестве субстратов, pBora 1–224 , но не его нефосфорилированная форма, значительно усиливала фосфорилирование гистона 3 AURKA T288V (дополнительная рис.4а, дорожки 4 и 5). Интересно, однако, что, хотя pBora 1–224 также была способна способствовать фосфорилированию гистона 3 AURKA WT (в небольшой степени), нефосфорилированный Bora 1–224 был еще более эффективным (дополнительная рис. 4a, полосы 1 и 2). Этот результат предполагает, что в некоторых контекстах присутствие фосфата как на Bora, так и на AURKA может привести к антагонистическим взаимодействиям.

Поскольку фосфомиметический вариант AURKA T288D часто используется в качестве заменителя конститутивно активного фермента, мы решили проверить, ведет ли этот вариант больше похоже на дикий тип или его аналог AURKA T288V в ответ на Bora.Поразительно, фосфомимитирующий Т-петлю мутант AURKA T288D вел себя более похоже на AURKA T288V , не обладая способностью фосфорилировать Plk1 на своей Т-петле отдельно или в присутствии Bora 1–224 , но обладая сильной способностью фосфорилировать Plk1 в присутствии pBora 1–224 (дополнительная рис. 4b). Таким образом, вариант AURKA T288D не является надежным прокси для активированной формы AURKA, полученной за счет связывания pBora. Мы пришли к выводу, что pBora является мощным активатором каталитической активности AURKA в отношении множества субстратов, особенно когда AURKA не фосфорилирован на своем активационном сегменте в T288, как показано на примере мутантов T288V и T288D AURKA.

AURKA

T288V функционирует в пути AURKA-Bora-Plk1 in vivo

Неожиданное наблюдение, что Cyclin-Cdk-фосфорилированный Bora может активировать AURKA даже в отсутствие фосфорилирования T288, побудило нас исследовать, может ли pBora аналогичным образом активировать мутант AURKA T288V in vivo. С этой целью мы использовали экстракты яиц Xenopus, приготовленные из ооцитов, задержанных в метафазе мейоза II (CSF: цитостатический фактор задержанных экстрактов). Экстракты CSF обычно останавливаются в митотическом состоянии с высокой активностью CyclinB-Cdk1 (MPF).На этом этапе киназа Greatwall (Gwl) активна и поддерживает митотическое состояние, ингибируя дефосфорилирование ключевых регуляторных факторов клеточного цикла протеинфосфатазой 2A PP2A-B55 (в комплексе с регуляторной субъединицей B55) 45 (рис. 4a) . Однако иммунодеплеция Gwl высвобождает активный PP2A-B55, который затем может дефосфорилировать субстраты CyclinB-Cdk1 и, следовательно, вызывать выход из митотического состояния 45 (рис. 4a, b). Дополнение экстрактов гиперактивным рекомбинантным Gwl K72M может восстановить митотическое состояние, если экстракты содержат активный путь AURKA, Bora и Plk1 (рис.4а, б).

Рис. 4: AURKA T288V поддерживает функцию AURKA в поддержании митотического состояния в ооцитах Xenopus с арестом CSF.

a В яичнике ооциты задерживаются в профазе мейоза I. Во время овуляции и при гормональной стимуляции (прогестероном) ооциты вновь вступают в мейоз и достигают второго деления мейоза, где задерживаются в метафазе II, ожидание оплодотворения (остановка спинномозговой жидкости). При иммунодеплеции Gwl (∆Gwl выделено красным) экстракты выходят из «митотического состояния».Дополнение экстракта рекомбинантной гиперактивной киназой Gwl K72M (+Gwl K72M зеленого цвета) восстанавливает митотическое состояние, если экстракты содержат функциональный путь Bora, AURKA, Plk1. GVBD: распад зародышевых пузырьков. Зеленая и красная области представляют собой высокую и низкую активность CyclinB-Cdk1 (MPF). b Сеть, представляющая пути, контролирующие активность Cyclin-Cdk и поддерживающие «митотическое состояние» в экстрактах яиц Xenopus с арестом CSF. c Блок-схема экспериментального подхода, используемого для проверки функциональности мутантов AURKA в поддержании «митотического состояния» в экстрактах ооцитов Xenopus, задержанных CSF.Эндогенные AURKA и Gwl были последовательно иммунодеплетированы из экстрактов яиц CSF, а затем дополнены рекомбинантной человеческой AURKA WT , каталитически мертвой AURKA D274N или подавленной миметической AURKA T288V и гиперактивной Gwl K72M () . Экстракты спинномозговой жидкости, не истощенные или последовательно лишенные AURKA (∆AURKA), а затем Greatwall (∆Gwl), разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител Xenopus Gwl и AURKA. Звездочки обозначают неспецифические полосы. d Экстракты яиц CSF, последовательно обедненные AURKA (∆AURKA), а затем Gwl (∆Gwl), были дополнены в момент времени 0 рекомбинантным AURKA WT или каталитически мертвым AURKA D274N или AURKA T288V в Гвл К72М . Часть экстрактов собирали в указанные моменты времени (0, 20, 40, 60, 90 мин) и анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием специфических антител для контроля уровней huGreatwall, Hu/Xe AURKA, Plk1, Cdc25, а также фосфорилирование Plx1 на T201 (pPlk1), фосфатазы PP1 на T320 (pPP1) и Cdk на Y15 (pTyr).Зеленая и красная область представляет собой высокую и низкую активность CyclinB-Cdk1 (MPF) («митотическое состояние»).

Воспользовавшись этой системой, мы проверили, может ли человеческий (hs) AURKA T288V заменить функцию Xenopus (Xe) AURKA в экстрактах спинномозговой жидкости. Для этого эндогенные Gwl и AURKA последовательно иммунодеплетировали, а затем в экстракт добавляли рекомбинантный гиперактивный Gwl K72M и либо hs AURKA WT , AURKA T288V , либо каталитически мертвый мутант AURKA D274N 4с). Как показано на рис. 4d (дорожка 3), экстракты с арестом CSF выходили из митотического состояния при иммунодеплеции Gwl, что отражалось в дефосфорилированном состоянии митотических субстратов Cdc25 и протеинфосфатазы 1 (PP1) и накоплении неактивного Cdk, фосфорилированного на ингибирующий сайт тирозина 15 (pTyr). Точно так же Plx1 (Xenopus Plk1) также быстро дефосфорилировался в своем сайте T-петли T201 (обозначенном pPlx1) при иммунодепелляции Gwl (∆Gwl) (рис. 4d, дорожки 3, 9 и 17). Дополнение экстракта рекомбинантным Gwl K72M и AURKA WT (дорожки 3–8), но не каталитически мертвым мутантом AURKA D274N (дорожки 17–22), в течение нескольких минут восстанавливало митотическое состояние.Активный Plx1, фосфорилированный по своей Т-петле (pPlx1), накапливался через 60–90  мин после дополнения экстрактов рекомбинантными Gwl K72M и AURKA WT . Это сопровождалось накоплением фосфорилированных митотических субстратов Cdc25 и PP1 и дефосфорилированием Cdk по тирозину 15 (рис. 4d, дорожки 7 и 8). Примечательно, что мутант AURKA T288V с пониженной экспрессией, подобный AURKA WT , способствует фосфорилированию Т-петли Plx1 и высокой активности Cyclin-Cdk в этих экстрактах с сопоставимой кинетикой (фиг.4г, дорожки 9–14). В совокупности эти результаты показывают, что AURKA T288V человека может поддерживать функцию AURKA в экстрактах ооцитов Xenopus. Мы заключаем, что в этом контексте и аналогично ситуации in vitro pBora может активировать AURKA независимо от фосфорилирования Т-петли на Т288 и, таким образом, может компенсировать отсутствие фосфорилирования Т-петли на AURKA.

Минимальный фрагмент Bora, включающий остатки 18–120, поддерживает AURKA-зависимое фосфорилирование Plk1 in vitro

минимально активный фрагмент Bora 1–224 (см.5а для схемы). Делеция Cy-мотивов (рис. 5a) в Bora отрицательно повлияла на нашу способность фосфорилировать Bora с помощью Cyclin-Cdk 25 (например, см. Дополнительный рисунок 5a). Поэтому мы использовали пролин-направленную MAP-киназу ERK вместо Cyclin-Cdk в наших реакциях предварительного фосфорилирования. Подтверждая этот подход, Bora, фосфорилированный с помощью ERK, и Bora, фосфорилированный с помощью CyclinA2-Cdk2, оба эффективно стимулировали фосфорилирование Plk1 T210 в нашем анализе восстановления (дополнительная рис.5б, сравните дорожки 1 и 6). Важно отметить, что сама ERK не могла напрямую фосфорилировать Plk1 в Т-петле (дополнительная рис. 5b, дорожка 5). Масс-спектрометрический анализ подтвердил, что ERK способна фосфорилировать все протестированные фрагменты Bora in vitro (дополнительная рис. 6a – i).

Рис. 5: Bora содержит Tpx2-подобные мотивы и уникальный фосфосайт, необходимый для его функции активации на AURKA in vitro.

a Схема Bora 1–224 с выделением десяти консенсусных сайтов S/T-P, которые фосфорилируются пролин-направленными киназами Cyclin-Cdk или ERK.Остаточное положение фосфосайтов указано и выделено буквой P (выше). Также выделены два циклин-связывающих мотива (Cy, фиолетовый) и два Tpx2-подобных мотива 1 и 2 (зеленый). Указаны границы различных фрагментов Bora, проанализированных в b d . Наиболее существенный фосфосайт S112 выделен большим P. b Вестерн-блот-анализ двухэтапных киназных реакций, проведенных с указанными фрагментами Bora, фосфорилированными (+) или не фосфорилированными (-) киназой ERK (стадия 1) в присутствии субстрата Plk1 K82R KD и AURKA WT или AURKA T288V (шаг 2).Блоты зондировали антителами к Bora, AURKA и фосфоТ210 Plk1 или pan Plk1, как указано (сверху вниз). c Выравнивание мотивов Bora M1 и M2 с мотивами Tpx2, ответственными за связывание с AURKA. Номера основных остатков в Tpx2, ответственных за связывание с AURKA, выделены красным под выравниванием. Соответствующие номера остатков в Bora выделены красным цветом над выравниваниями. Также показан фосфомотив M3 в Bora, не законсервированный в Tpx2. d Вестерн-блот анализ киназных реакций, проведенный с указанными мутантами Bora 18–120 (S27A и T52A плюс/минус мутации в пределах мотивов M1 или M2), фосфорилированными (+) или не фосфорилированными (-) киназой ERK (шаг 1) в присутствии Plk1 K82R KD и AURKA WT или AURKA T288V (этап 2).Блоты зондировали антителами к Bora, AURKA и фосфоТ210 Plk1 или pan Plk1, как указано (сверху вниз). Обратите внимание, что мутант Bora 18–120 [S27A T52A F103D F104D] не распознавался нашим антителом к ​​Bora, но окрашивание кумасси реакции стадии 1 (нижняя панель стадии 1) выявило присутствие белка ожидаемого размера.

Затем мы проверили способность фрагментов делеции Bora поддерживать фосфорилирование Plk1 с помощью AURKA WT или AURKA T288V .pBora 1–224 поддерживал наиболее эффективное фосфорилирование Plk1 как AURKA WT , так и AURKA T288V (рис. 5b, дорожки 1–4). N- и C-концевые делеции в Bora 1–224 в виде фрагмента Bora 35–157 отменяют все стимулирующие функции (дорожки 5–8). Учитывая, что N-концевая часть Bora высококонсервативна 25 , мы расширили N-концевую часть Bora 35–157 для восстановления активности. В то время как фрагмент Bora 35–157 был полностью неактивным, Bora 18–157 был способен стимулировать AURKA WT и AURKA T288V , аналогичные Bora 1–224 (дорожки 9–12).Аналогично, Bora 18–120 был способен стимулировать AURKA WT и AURKA T288V (дорожки 13–16). В совокупности эти результаты показывают, что фрагмента Bora 18–120 достаточно для стимуляции каталитической функции AURKA по отношению к Plk1.

Поскольку фосфорилирование Bora 18–120 пролин-направленной киназой в значительной степени способствовало ее способности стимулировать каталитическую активность AURKA (особенно мутанта AURKA T288V ), мы использовали сайт-направленный мутагенез, чтобы определить, какие специфические фосфо -сайты в Боре были ответственны (рис.5б, правая панель). Bora 18–120 содержит четыре сайта S/TP, S27, S41, T52 и S112, которые соответствуют консенсусной последовательности Cyclin-Cdk. Совместная мутация S27 и T52 не влияла на стимулирующую AURKA активность Bora 18–120 (дорожки 17–24), но добавление третьей мутации либо к S41 (дорожки 25–28), либо к S112 (дорожки 29–32) ) в некоторой степени нарушил его функцию. В частности, тройной мутант Bora 18–120 [S27A S41A T52A] , фосфорилированный или не фосфорилированный ERK, потерял всю способность активировать AURKA WT , но сохранил способность активировать AURKA T288V при предварительном фосфорилировании ERK (i .е. фосфорилирован только по S112) (дорожка 27). Напротив, тройной мутант Bora 18–120 [S27A T52A S112A] , фосфорилированный или не фосфорилированный ERK (только на S41), не только потерял всю способность активировать AURKA WT , но и AURKA T288V (дорожки 29– 32). Чтобы подтвердить большую важность фосфорегуляторного сайта S112, мы проанализировали мутанты Bora 18–120 [S41A] и Bora 18–120 [S112A] с одним сайтом. В соответствии с ожиданиями, хотя Bora 18–120 [S41A] потерял способность активировать AURKA WT , он все же сохранил способность активировать AURKA T288V при предварительном фосфорилировании с помощью ERK.Напротив, Bora 18–120 [S112A] , фосфорилированный или не фосфорилированный ERK, потерял способность активировать как AURKA WT , так и AURKA T288V (дополнительный рисунок S5c). Вместе эти результаты показывают, что Bora 18–120 , фосфорилированного по сайту S112 Cyclin-Cdk, минимально достаточно для потенцирования каталитической активности AURKA T288V по отношению к Plk1. Эти результаты также показывают, что фосфорилирование Bora на S112 может компенсировать отсутствие фосфорилирования Т-петли на AURKA.Поскольку мутация Ser41 неблагоприятно влияет на способность как Bora, так и pBora активировать AURKA, мы считаем, что этот остаток может играть важную структурную и не зависящую от фосфорилирования роль в поддержании взаимодействия Bora-AURKA.

Bora содержит два коротких Tpx2-подобных мотива, необходимых для активации AURKA

Белок Tpx2, ассоциированный с микротрубочками, является хорошо охарактеризованным аллостерическим активатором AURKA. Кристаллическая структура комплекса Tpx2/AURKA (PDB: 1OL5) показала, как Tpx2 использует свои первые 43 аминокислоты для связывания каталитического домена AURKA 40,41,46 .Сравнение последовательности Bora 18–120 с первыми 43 остатками Tpx2 выявило две области сходства, обозначенные мотивом 1 (M1; остатки 25–34 в Bora) и мотивом 2 (M2; остатки 101–110 в Bora) (рис. 5в). Мотив 1 Tpx2 (остатки 7–21) принимает расширенную конформацию, которая связывается с N-концевой долей AURKA, в то время как мотив 2 (остатки 30–43) принимает альфа-спиральную конформацию, которая связывается между N- и C-концевыми долями, соседними к спирали αC и сегменту активации 40 .

Внутри двух мотивов Tpx2 Tyr8, Tyr10, Phe16, Phe19, Trp34 и Phe35 имеют решающее значение для связывания с AURKA 47,48,49 . Примечательно, что Tyr10, Phe16, Phe19, Trp34 и Phe35 в Tpx2 также сохраняются в двух аналогичных мотивах у Bora, хотя и с большим разделением мотивов (рис. 5c). Более того, общий паттерн гидрофобности и полярности двух мотивов, по-видимому, сохраняется, указывая на то, что Bora может задействовать AURKA сходным образом с Tpx2.

Чтобы проверить эту гипотезу, мы мутагенизировали Bora 18–120 (несущий доброкачественную двойную мутацию S27A/T52A), заменив ключевые гидрофобные остатки отрицательно заряженными остатками в M1 (F25D/Y31D) и в M2 (F103D/F104D).Тестирование каждой конструкции в наших реакциях in vitro показало, что мутации в M1 или M2 отменяют стимулирующую активность Bora 18–120 в отношении AURKA (рис. 5d, дорожки 5–12). Вместе эти результаты выявили три существенных детерминанта в Bora для стимулирования AURKA фосфорилирования Plk1, а именно два Tpx2-подобных мотива M1 и M2 в дополнение к фосфорегуляторному сайту Cyclin-Cdk в Ser112 (обозначенном M3).

Bora и Tpx2 конкурируют за связывание AURKA и проявляют разные способности активировать AURKA

Обнаружение того, что Bora и Tpx2 имеют сходные мотивы для связывания с AURKA, позволяет предположить, что эти два белка могут связываться с AURKA конкурентным образом.Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели анализ связывания с конкурентным замещением, используя меченный флуоресцеином Tpx2 1–43 (FITC-Tpx2 1–43 ) в качестве зонда (схему см. на рис. 6a). По оценке измерения поляризации флуоресценции, FITC-Tpx2 1–43 связывался с AURKA WT и AURKA T288V со значениями K d , равными 0,009 мкМ и 0,015   соответственно (рис. 6b, d, 0,015). Поддерживая идею сходных способов связывания, Tpx2 1–43 , Bora 1–224 и pBora 1–224 могут конкурентно вытеснять FITC-Tpx2 1–43 от связывания с AURKA WT (рис. .6в) и к AURKA T288V (рис. 6д). Примечательно, что Tpx2 1–43 оказался более эффективным, чем pBora 1–224 и Bora 1–224 , при конкурентном связывании с AURKA WT (IC 50  = 0,1 мкМ, соответственно, 2,7 мкМ) и ND =  0,1 мкМ. , тогда как pBora 1–224 оказалась более эффективной, чем Tpx2 1–43 или Bora 1–224 при конкурентном связывании с AURKA T288V (IC 50  = 0,131 и 0,7 мкМ соответственно). Отметим, что хотя общие тенденции предпочтения связывания, наблюдаемые по поляризации флуоресценции (рис.6) и SPR (рис. 2 и 3) аналогичны, аффинности связывания в эксперименте SPR кажутся заниженными, возможно, из-за иммобилизации Bora через его N-конец.

Рис. 6: Bora и Tpx2 1–43 конкурируют за связывание AURKA.

a Схема анализа связывания с конкурентным замещением с использованием меченного флуоресцеином Tpx2 1–43 (FITC-Tpx2 1–43 ) в качестве зонда. Комплексообразование между FITC-меченым полипептидом Tpx2 1–43 и AURKA с последующей разборкой комплекса FITC-Tpx2 1–43 / AURKA за счет увеличения количества конкурента (холодный Tpx2 1–43 , Bora или pBora ) контролировали по поляризации флуоресценции. b Связывание меченного флуоресцеином полипептида Tpx2 1–43 с AURKA WT оценивали путем мониторинга сигнала поляризации флуоресценции в присутствии возрастающих концентраций AURKA WT . K d значение представляет собой среднее значение со стандартными отклонениями среднего значения в виде баров ошибок ( n  = 3 независимых выборки эксперимента). c Анализ конкурентного связывания, при котором меченный флуоресцеином полипептид Tpx2 1–43 в комплексе с AURKA WT замещается возрастающим количеством конкурента (холодный Tpx2 1–43 , Bora 1–224 1–224 ) и отслеживается по сигналу поляризации флуоресценции.Отображаемые точки данных и значение полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC 50 ) представляют среднюю поляризацию флуоресценции для каждого условия реакции со стандартными отклонениями среднего значения в виде баров ошибок ( n  = 3 независимых экспериментальных образца). НД: не определено. d Связывание меченного флуоресцеином полипептида Tpx2 1–43 с AURKA T288V оценивали путем мониторинга сигнала поляризации флуоресценции в присутствии возрастающих концентраций AURKA T288V . K d значение представляет собой среднее значение со стандартными отклонениями среднего значения в виде баров ошибок ( n  = 3 независимых выборки эксперимента). e , f Анализ конкурентного связывания, при котором меченный флуоресцеином полипептид Tpx2 1–43 в комплексе с AURKA T288V замещается увеличивающимся количеством холодного Tpx2, Bora 1–224 1–224 или pBora3 ( e ), или увеличением количества холодных pBora 1–224 , pBora 18–120 или указанных мутантов pBora 18–120 в мотивах M1 и M2.Данные представлены как в c . г Активация AURKA WT АТФазной активности Bora 1–224 , pBora 1–224 и Tpx2 1–43 по оценке с использованием анализа ADP-Glo ​​с субстратом Kemptide. Отображаемые точки данных и значения EC 50 представляют среднюю люминесценцию для каждого условия реакции со стандартными отклонениями среднего значения в виде планок погрешностей ( n  = 3 независимых образца эксперимента). RLU: относительная световая единица. h Активация AURKA T288V АТФазная активность с помощью Bora 1–224 , pBora 1–224 и Tpx2 1–43 по оценке с использованием анализа ADP-Glo ​​с субстратом Kemptide.Данные представлены как г . i Активность комплекса AURKA T288V /pBora 1–224 в присутствии возрастающей концентрации конкурента Tpx2 1–43 или Bora 1–224 оценивали с помощью анализа ADP-Glo ​​в присутствии Кемптидный субстрат. Отображенные точки данных и значение полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC 50 ) представляют собой среднее значение флуоресцентной люминесценции для каждого условия реакции со стандартными отклонениями среднего значения в виде баров погрешностей ( n  = 3 независимых образца эксперимента).НД: не определено.

В соответствии с ожиданиями, более короткая конструкция pBora 18–120 вела себя аналогично pBora 1–224 по своей способности вытеснять FITC-Tpx2 1–43 из AURKA T288V ≈20 с меньшим эффективность (рис. 6f). Введение замен аспарагиновой кислоты в гидрофобные мотивы M1 и M2 резко снижало функцию замещения Tpx2 1–43 (рис. 6f), что согласуется с нашими выводами о том, что эти мутации лишают pBora 18–120 способности активировать AURKA T288V. фосфорилирование Plk1 (фиг.5г). Вместе эти результаты подтверждают предсказание о том, что Bora и Tpx2 имеют сходные свойства связывания с AURKA. Кроме того, они демонстрируют оптимальное связывающее взаимодействие, когда фосфорилируется Bora и когда AURKA не фосфорилируется.

Различное кажущееся сродство связывания Tpx2 1–43 , Bora 1–224 и pBora 1–224 по отношению к AURKA WT и AURKA T288V привело к на активность AURKA с использованием анализа ADP-Glo.В соответствии с исследованиями конкурентного связывания, Tpx2 1–43 продемонстрировал более высокий активирующий потенциал по сравнению с pBora 1–224 и Bora 1–224 на AURKA WT (рис. 6g). Удивительно, но, несмотря на свою способность связывать AURKA T288V , Tpx2 1–43 (как и Bora 1–224 и в отличие от pBora 1–224 ) не проявляли способности активировать AURKA T288V (рис.    ). Кроме того, в соответствии с их способностью связывать, но не активировать AURKA T288V , как Tpx2 1–43 , так и Bora 1–224 действовали как конкурентные ингибиторы активации pBora 1–224 AURKA T288V (рис.6и). Принимая за чистую монету, эти результаты недвусмысленно демонстрируют, что Bora и Tpx2 конкурируют за связывание с AURKA со сродством и возможностями активации, зависящими от статуса фосфорилирования как Bora, так и AURKA. Эти результаты перекликаются с предыдущими наблюдениями, показывающими, что истощение Bora в клетках человека увеличивает ассоциацию Tpx2 с AURKA на митотическом веретене, в то время как сверхэкспрессия N-концевого фрагмента Bora (Bora N-ter [1-379] ) предотвращает коиммунопреципитацию Tpx2 с AURKA 31 .

Мутационный анализ предполагаемых фосфо-связывающих сайтов на AURKA

Наши результаты in vivo и in vitro показывают, что pBora может компенсировать отсутствие фосфорилирования Т-петли в AURKA. Возникает вопрос, как структурно это достигается. Одна из возможностей заключается в том, что фрагмент фосфоSer112 Bora связывается с тем же сайтом на AURKA, который обычно взаимодействует с фосфорилированным остатком T-петли T288 AURKA в цис . Это предполагает координацию Arg255, Arg180 и Arg286 (рис.7а и дополнительный рис. 1). Насколько нам известно, не было описано ни одного прецедента регулятора киназы, действующего таким образом. Альтернативная возможность заключается в том, что мотив фосфоSer112 связывается с сайтом, отличным от фосфорилированной Т-петли на AURKA. Например, коструктура Tpx2-AURKA (PDB: 1OL5) обнаруживает соседний и частично перекрывающийся сайт связывания, включающий His176, Arg180 и Arg286, который координирует свободный ион сульфата (рис. 7a). Прецедент для этого сайта в координации фосфата был установлен для AURKC, который регулируется связыванием с центромерой и регулятором митоза INCENP 50 .Один из двух фосфосайтов в INCENP (в мотиве TSS) связывается с соответствующим сайтом связывания сульфата, консервативным с AURKA (см. Дополнительный рисунок 7a, b). Из четырех остатков, участвующих в двух соседних сайтах связывания, только Arg255 уникален для координации фосфорилированного остатка Т-петли T288, тогда как только His176 уникален для координации сульфат-иона (рис. 7a и дополнительная рис. 1).

Рис. 7: Bora связывает AURKA посредством двух Tpx2-подобных мотивов, которые располагают фосфо-мотив в активном сайте киназы.

a Увеличенный вид интерфейса привязки между Tpx2 и AURKA (PDB: 1OL5). Фосфоростаток Thr288 Т-петли, ион сульфата (желтый) и координирующие остатки фосфо-Т-петли и сульфат-иона AURKA (h276, R180, R255 и R286) выделены палочкой. b Связывание меченного флуоресцеином полипептида Tpx2 1–43 с мутантами AURKA оценивали путем мониторинга сигнала поляризации флуоресценции в присутствии возрастающих концентраций мутантов AURKA. K d значения представляют собой среднее значение со стандартными отклонениями среднего значения в виде баров ошибок ( n  = 3 независимых выборки эксперимента). c Вестерн-блот анализ двухэтапных киназных реакций, проведенных с использованием Bora 18-120 [S27A T52A] , фосфорилированного (+) или не фосфорилированного (-) киназой ERK (стадия 1) в присутствии Plk1 K82R KD (субстрат) и AURKA WT или мутированные версии, как указано (шаг 2). Блоты зондировали антителами к Bora, AURKA и фосфоТ210 Plk1 или pan Plk1, как указано (сверху вниз). d Конкурентное замещение меченого флуоресцеином Tpx2 1–43 из указанных мутантов AURKA за счет повышения концентрации pBora 1–224 , контролируемое по поляризации флуоресценции. Отображаемые точки данных и значение полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC 50 ) представляют собой средний нормализованный сигнал поляризации флуоресценции для каждого условия реакции (начальный сигнал связывания = 100%, сигнал связывания в конце титрования = 0%) ( n  = 3 независимых экспериментальные образцы). e Теоретическая/иллюстративная модель связывания pBora с киназным доменом AURKA. AURKA показана серой поверхностью со спиралью αC, выделенной желтым цветом. Мотивы Bora M1 (синий) и M2 (фиолетовый) моделировались двумя соответствующими мотивами из Tpx2, а фосфо-мотив M3 (розовый) моделировался мотивом TSS из фосфо-INCENP.

Чтобы исследовать участие двух вышеупомянутых сайтов AURKA в связывании с фосфатным фрагментом в Bora, мы индивидуально заменили остатки His176, Arg180, Arg255 и Arg286 на аланин в AURKA T288V и проверили чувствительность к pBora 18–120 в анализах протеинкиназы.Все четыре мутанта AURKA (AURKA [T288V H276A] , AURKA [T288V R180A] , AURKA [T288V R255A] , и AURKA [T288V R286A] ), которые сохраняли способности для связывания TPX2 1-43 (ссылка 47 и рис. 7b), продемонстрировали пониженную чувствительность к pBora 18–120 (рис. 7c). Эти наблюдения подтвердили роль остатков His176, Arg180, Arg255 и Arg286 AURKA в координации фосфатного фрагмента в Bora. Для дальнейшего изучения этого вопроса мы проверили способность четырех мутантов AURKA связывать pBora 1–224 .Воспользовавшись тем, что все четыре мутанта AURKA связываются с одинаковой аффинностью к FITC-Tpx2 1–43 (рис. 7b, за исключением 3-кратного снижения связывания для AURKA [T288V R255A] ), мы измерили конкурентное замещение FITC. -Tpx2 1–43 от каждого мутанта AURKA с помощью pBora 1–224 . В то время как pBora 1–224 конкурентно вытесняла Tpx2 1–43 из AURKA T288V с IC 50 , равной 35 нМ, она была в 8-, 20-, 22- и 15-кратном снижении вытеснения 903 Tpx. 1-43 от AURKA [T288V H276A] , AURKA [T288V R180A] , AURKA [T288V R255A] , и AURKA [T288V R286A] Мутантов (IC 50 971 и 516 нМ) соответственно (рис.7г). В совокупности эти данные предоставляют убедительные доказательства того, что His176, Arg180, Arg286 и Arg255 участвуют в координации фрагмента фосфо-S112 в Bora, который необходим для надежной активации AURKA T288V. Результаты также согласуются с моделью, в которой фрагмент фосфо-S112 в Bora функционально и, возможно, структурно заменяет фрагмент фосфо-T288 в Т-петле, который обычно необходим для активации AURKA (рис. 7e).

Детерминанты Bora имеют решающее значение для входа в митоз в экстрактах яиц Xenopus

Определив, что Tpx2-подобные мотивы (M1 и M2) и фосфорилированный серин Ser112 (M3) необходимы в контексте минимального Bora 18–120 фрагмент для функции in vitro, затем мы исследовали актуальность этих детерминант для функции Bora in vivo.Сначала мы исследовали функцию Bora при митотическом вступлении в экстракты яиц Xenopus, используя вариант экспериментальной установки, описанной ранее , посредством чего экстракты интерфазных яиц вынуждены вступать в митоз с помощью киназы Gwl 27,45 . Добавление рекомбинантной гиперактивной киназы Gwl (Gwl K72M ) к интерфазным экстрактам частично ингибирует PP2A-B55, стабилизируя фосфорилирование субстрата базальной активностью Cyclin-Cdk, которая вызывает вступление в митоз. Однако предварительное иммунодеплеция Bora из этих экстрактов предотвращает вступление в митоз.В этих условиях ингибируется активация Plx1 с помощью AURKA и удаление ингибирующего фосфорилирования Cdk (в частности, Tyr15). Этот митотический дефект входа может быть полностью устранен добавлением рекомбинантного Bora 27 дикого типа. Следовательно, мы проверили, могут ли минимальные фрагменты Bora, которые поддерживают фосфорилирование Plk1 с помощью AURKA in vitro, способствовать вступлению в митоз в интерфазных экстрактах, лишенных Bora (рис. 8a). Мы снова использовали ERK для предварительного фосфорилирования фрагментов Bora на сайтах S/TP, как мы это делали в наших реакциях in vitro, чтобы обойти неэффективное фосфорилирование некоторых конструкций с делециями Bora с помощью CyclinA-Cdk1 в экстрактах яиц Xenopus.

Рис. 8: Tpx2-подобные мотивы и фосфорилирование серина 112 необходимы для функции Bora при вступлении в митоз в экстрактах яиц Xenopus.

a Схема структурно-функционального анализа Bora при вступлении в митоз в экстрактах яиц Xenopus. Интерфазные экстракты (красные) были истощены антителами Bora и через 30 минут были дополнены фрагментами Bora (предварительно фосфорилированными киназой ERK) и рекомбинантной гиперактивной киназой Gwl K72M , чтобы вызвать митотический вход.Образцы собирали в разные моменты времени и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга (0, 20, 40, 60  мин) с использованием митотических маркеров, чтобы определить, вступают ли экстракты в митоз (зеленый) или нет. Вестерн-блоттинг показывает уровни эндогенного бора до (входные данные) и после (Sn: супернатант) иммунодеплеции (Ip) из экстрактов яиц Xenopus. b Интерфазные экстракты иммунодеплетировали с использованием антител против Bora и через 30 мин добавляли рекомбинантный гиперактивный Gwl K72M и Bora 1–224 (дорожки 2–5), Bora 35–157 (дорожки 6–9) ), Bora 1–224 (полосы 11–14), Bora 18–157 [S27A T52A] (полосы 15–18), Bora 18–120 [S27A T52A] (полосы 19–22).Фракции экстрактов собирали в указанные моменты времени (0, 20, 40, 60 мин) и анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием специфических антител для мониторинга уровней huGwl, ERK, Plk1, huBora и фосфорилирования Plx1 на T201 ( pPlk1), фосфатаза PP1 на треонине 320 (pPP1), Cdk на Tyr15 (pTyr) и ERK на Thr202 и Tyr204. Зеленые и красные области внизу представляют периоды высокой и низкой активности CyclinB-Cdk1 (MPF). c Интерфазные экстракты были иммунодеплетированы с использованием антител против Bora, а через 30 минут добавлен рекомбинантный гиперактивный Gwl (Gwl K72M ) и Bora 18–120 [S27A T52A] (дорожки 2–5), Bora 18–120 [S27A T52A F25D Y31D] (полосы 6–9), Bora 18–120 [S27A T52A F103D F104D] (полосы 10–13).Фракции экстрактов собирали в указанные моменты времени (0, 20, 40, 60 мин) и анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием специфических антител для контроля уровней Gwl, ERK, Plk1 и Bora, а также фосфорилирования Plx1. на T201 (pPlk1), фосфатазу PP1 на треонине 320 (pPP1) и Cdk на Tyr15 (pTyr). Зеленые и красные области внизу представляют периоды высокой и низкой активности CyclinB-Cdk1 (MPF).

В соответствии с нашими предыдущими наблюдениями, Bora 1–224 , предварительно фосфорилированный с помощью ERK, полностью восстановил митотический вход в интерфазный экстракт, лишенный Bora 27 .Как показано на рис. 8b (дорожки 2–5), добавление гиперактивного Gwl K72M к истощенному лизату (дорожка 1) приводило к резкому увеличению фосфорилирования Plx1 на 20  мин, за которым следовало вступление в митоз, о чем свидетельствует постепенная потеря ингибирующего фосфорилирования Tyr15 на CyclinB-Cdk1 и ингибирующего фосфорилирования на фосфатазе PP1. Напротив, Bora 35–157 , лишенный M1, не продемонстрировал способности восстанавливать дефект входа в митоз (несмотря на эффективное фосфорилирование с помощью ERK, дополнительная рис.S5), о чем свидетельствует сохранение ингибирующего фосфорилирования Tyr15 на CyclinB-Cdk1 и отсутствие фосфорилирования PP1 (рис. 8b, дорожки 6–9). Подобно Bora 1–224 , обе конструкции Bora 18–157 и Bora 18–120 , несущие мутации S27A и T52A в двух фосфоакцепторных сайтах Cyclin-Cdk, были полностью способны поддерживать митотическое вступление интерфазных экстрактов, истощенных Бора. В обоих случаях добавление Gwl K72M сопровождалось активацией Plx1 и вступлением в митоз, о чем свидетельствует фосфорилирование PP1 и дефосфорилирование Cdk1 на Tyr15 (рис.8b, дорожки 15–18 и дорожки 19–22).

Затем мы проверили, необходимы ли сходным образом Tpx2-подобные мотивы M1 и M2 Bora для функции Bora при вступлении в митоз. Как показано на рис. 8c, Bora 18–120 , несущий доброкачественные мутации S27A и T52A вместе с мутациями в любом из мотивов M1 (F25D Y31D) или M2 (F103D F104D), не поддерживал митотическое вхождение в экстракты яиц Xenopus. В обоих случаях Plx1 не фосфорилировался/активировался при добавлении активного Gwl K72M , и экстракты не достигали митотического состояния, о чем свидетельствует сохранение ингибирующего фосфорилирования Tyr15 на Cdk1 и отсутствие фосфорилирования PP1 (рис.8с). Взятые вместе, эти результаты подтверждают наши наблюдения in vitro, согласно которым Bora 18-120 минимально достаточен для стимуляции фосфорилирования Plk1 с помощью AURKA и для обеспечения входа в митоз. Эти наблюдения также указывают на то, что два Tpx2-подобных мотива M1 и M2 вместе с пре-фосфорилированием регуляторных сайтов Cyclin-Cdk являются критическими для функции Bora при митотическом вступлении в экстракты яиц Xenopus.

Остаток S112 и Tpx2-подобные мотивы необходимы для функции Bora во время митотического вступления в клетки человека минимальный фрагмент Bora

18–120 для функции in vitro и в экстрактах яиц Xenopus, затем мы исследовали, необходимы ли эти детерминанты также для полноразмерной функции Bora при митотическом вступлении во время клеточного цикла человека.С этой целью мы использовали технологию CRISPR/Cas9 для мечения эндогенного Bora на С-конце с помощью NeonGreen (NG) и ауксин-индуцируемого мотива degron (AID) (обозначаемого как Bora-NG-AID) в клетках DLD1, конститутивно экспрессирующих белок F-box. TIR1 (рис. 9а). После обработки клеточной линии Bora-NG-AID DLD1 ауксином (A) SCF TIR-1 E3-лигаза нацелена на Bora-NG-AID для деградации протеасомой 26S, что приводит к нокдауну Bora 51 (дополнительная рис. 8а–в). Используя CRISPR/Cas9, мы также ввели в локус AAVS1 либо дикий тип, либо мутантный вариант Bora под контролем промотора, индуцируемого доксициклином (рис.9а). Варианты Bora включали мутантов фосфо-сайта BORA S41A , BORA S112A (нарушение мотива M3), BORA S137A , BORA 3A [S41A, S112A, S137A] , удаление мутантный BORA Δ35 , и мутантные формы Bora [F25D Y31D] и Bora [F103D F104D] с нарушениями TPX2-подобных мотивов M1 и M2 соответственно. Мы специально протестировали тройной мутант Bora 3A [S41A S112A S137A] , а также отдельные мутанты Bora фосфозита, потому что ранее мы показали, что Bora 3A дефектен в митотическом входе после восстановления контрольной точки после повреждения ДНК 25,26 .

Рис. 9: Остаток S112 и Tpx2-подобные мотивы необходимы для функционирования Bora во время клеточного цикла млекопитающих.

a Схема структурно-функционального анализа Bora во время клеточного цикла млекопитающих. Эндогенный Bora, расположенный на хромосоме (Chr) XIII, был помечен на С-конце Neongreen (NG) и ауксин-индуцируемым дегроном (AID) в клетках DLD1, конститутивно экспрессирующих субъединицу Tir1 SCF TIR1 E3-лигазы. Копия немеченого Bora дикого типа или мутантная копия, управляемая промотором доксициклина (pTRE3G), была встроена в Chr XIX тех же клеток с помощью редактирования генома CRISPR/Cas9.Доксициклин способствует экспрессии немеченого Bora дикого типа или мутантного типа, в то время как ауксин индуцирует опосредованную SCF TIR1 протеасомную деградацию Bora-NG-AID, приводящую к нокдауну Bora. b Рабочий процесс, используемый для отслеживания прохождения клеток через клеточный цикл. Экспрессию Bora WT или указанных мутантов индуцировали доксициклином во время второго тимидинового блока. Затем Bora-NG-AID истощали во время высвобождения из DTB с использованием ауксина. Клетки собирали через 10 и 13 ч после высвобождения DTB для вестерн-блоттинга и анализа FACS. c Гистограммы, показывающие распределение клеточного цикла (процент клеток в G1, S и G2/M) для клеточных линий DLD1-Bora-NG-AID, экспрессирующих либо Bora WT , либо Bora [S41A S112A S137A] и обработаны, как указано в b . AS: асинхронные ячейки; Ctrl: необработанный; A: клетки, обработанные ауксином; A/D: клетки, обработанные доксициклином + ауксином. d На прямоугольных диаграммах показаны медиана (средняя линия) и минимум-максимум (вискеры), показывающие количественный индекс спасения (RI) для каждой клеточной линии DLD1 Bora-NG-AID, экспрессирующей Bora WT (темно-зеленый цвет) или указанные мутанты: Bora [S41A S112A S137A] (красный), Bora S41A (синий), Bora S112A (оранжевый), Bora S137A (зеленый), Bora ∆35 (пурпурный), Bora [F25D Y31D] (розовый) и Bora [F103D F104D] (фиолетовый) оценивали через 10 (первый столбец) и 13 (второй столбец) часов после выброса DTB; n указывает количество повторов. e Вестерн-блот-анализ белковых лизатов из клеточной линии DLD1-Bora-NG-AID, экспрессирующей Bora WT или указанные мутанты, через 10 ч после высвобождения DTB, как показано на b , c и d . Для этих анализов использовали антитела Bora, pT210-Plk1 и panPlk1 (сверху вниз). (-) Асинхронные ячейки.

Используя эту экспериментальную установку, мы исследовали функцию мутантного бора во время клеточного цикла человека, комбинируя истощение эндогенного бора при добавлении ауксина с индукцией немеченого бора под действием доксициклина (D) (рис.9а и дополнительный рис. 8а–в). Сначала мы исследовали эффект истощения Bora при обработке ауксином в клетках DLD1, экспрессирующих Bora-NG-AID. В течение 2 часов после обработки ауксином мы наблюдали быструю деградацию Bora-NG-AID, которая сопровождалась серьезным снижением фосфорилирования Plk1 на T210 в несинхронизированных клетках (дополнительная рис. 8d). Чтобы строго оценить влияние истощения Bora-NG-AID на прогрессирование клеточного цикла, мы синхронизировали клетки в фазе G1-S с помощью двойного тимидинового блока (DTB), а затем освободили клетки, вымывая тимидин.Мы отслеживали прогрессирование митоза с помощью FACS и вестерн-блоттинга маркеров клеточного цикла (рис. 9b и дополнительные рисунки 8e, f и 9). В соответствии с предыдущими экспериментами RNAi 22 , истощение Bora-NG-AID сильно задерживает митотический вход. В то время как необработанные клетки накапливали митотический маркер гистона h4 через 8 часов после высвобождения из DTB, клетки, обработанные ауксином, накапливали этот маркер только через 12 часов после высвобождения из DTB (дополнительная рис. 8e, f). Анализ FACS подтвердил эти результаты и показал, что клетки, лишенные Bora-NG-AID, медленнее вступают в митоз с задержкой на 4 часа (дополнительная рис.8е).

Затем мы исследовали способность мутантов Bora обращать наблюдаемые эффекты при индуцированном ауксином истощении Bora-NG-AID. Мы рассчитали индекс восстановления (RI), который отражает способность немеченого Bora восстанавливать задержку митотического входа в результате эндогенной деградации Bora-NG-AID (рис. 9c, d). Вкратце, для каждой мутантной клеточной линии Bora мы выполнили DTB и режим высвобождения и определили с помощью FACS процент клеток в фазах G2 и M как через 10 часов, так и через 13 часов после высвобождения (рис.9б). Эти эксперименты проводились в трех условиях: клетки либо не обрабатывали для использования в качестве эталонных контролей (Ctrl), либо обрабатывали ауксином (A) для деградации Bora-NG-AID, либо обрабатывали ауксином плюс доксициклин (A/D) для деградации Bora-NG-AID. NG-AID и одновременно индуцируют экспрессию WT Bora или его мутантов (рис. 9b). RI рассчитывали как функцию клеток в G2-M при трех различных условиях (RI = [A-A/D] / [A-Ctrl]) (рис. 9d). Как показано на рис. 9c, процент клеток в фазах G2 и M увеличился в клетках, лишенных Bora-NG-AID, по сравнению с необработанными контрольными клетками из-за задержки входа в митоз (дополнительная рис.8д, е). Если повторная экспрессия варианта Bora должна была в какой-то степени спасти этот фенотип, процент клеток в G2-M должен уменьшиться по сравнению с обработкой только ауксином. Если спасение было завершено, процент клеток в G2-M должен быть равен проценту, наблюдаемому для необработанных контрольных клеток (RI   =   1). Если спасения не происходило, процент клеток в G2-M должен быть равен проценту, наблюдаемому для клеток, обработанных ауксином (RI   =   0).

Как показано на рис. 9d, значение RI 0,5 наблюдалось при индукции экспрессии Bora дикого типа через 10 и 13 ч после высвобождения из второго тимидинового блока.Это указывало на то, что Bora дикого типа частично устраняла задержку митоза, возникающую в результате истощения Bora-NG-AID, возможно, из-за более низкого уровня экспрессии по сравнению с эндогенным Bora (рис. 9e, сравните дорожки 1 и 3). Bora S41A и Bora S137A продемонстрировали очень схожие способности восстанавливать задержку клеточного цикла в результате истощения эндогенного Bora-NG-AID (рис. 9d). Напротив, Bora [S41A S112A S137A] , Bora S112A , Bora [F25D Y31D] , Bora [F103D F104D] и Bora ∆23 не проявляли способность к задержке G 90–M ∆23 . несмотря на то, что все белки эффективно экспрессировались при добавлении доксициклина (рис.9д). Мы подтвердили эти наблюдения, отслеживая фосфорилирование T210 на Plk1 через 10 часов после высвобождения из DTB (рис. 9e). Сигнал фосфорилирования T210 был сильно уменьшен при добавлении ауксина, и он был восстановлен за счет индуцированной доксициклином экспрессии Bora WT (рис. 9e, сравните дорожки 1, 2 и 3). Доксициклин-индуцированная экспрессия Bora S41A и Bora S137 сходным образом восстанавливала высокие уровни фосфорилирования T210 (рис. 9e, дорожки 9 и 15), в то время как другие мутанты Bora Bora [S41A S112A S137A] , Bora

S3224 Bora [F25D Y31D] , Bora [F103D F104D] и Bora ∆35 не смогли этого сделать (дорожки 6, 12, 18, 21 и 24).

Чтобы избежать потенциальных осложнений, возникающих в результате лечения тимидином, мы отслеживали митотический вход с помощью покадровой видеомикроскопии в популяциях асинхронных клеток DLD1, экспрессирующих Bora-NG-AID и индуцируемых доксициклином Bora WT или Bora S112A , используя RCC1 с флуоресцентной меткой. -iFP2 как репортер NEBD (дополнительная рис. 10a, b). Для каждого состояния анализировали более 1000 клеток. Истощение бора при добавлении ауксина сильно задерживает митотический вход по крайней мере на 4 часа. Этот фенотип был частично восстановлен путем индукции Bora WT (+ доксициклин за 5 часов до добавления ауксина) (дополнительная рис.10б). И наоборот, экспрессия мутантной формы Bora S112A была полностью неспособна восстановить кинетику вступления в митоз (дополнительная рис. 10c), что подтверждает наши результаты, полученные с клетками, синхронизированными режимом высвобождения DTB. В совокупности эти результаты показывают, что Tpx2-подобные мотивы (M1, M2) и фосфорилирование S112 (M3) являются важными детерминантами для функции Bora при активации Plk1 и вступлении в митоз во время клеточного цикла человека. Эти результаты также полностью согласуются с нашими данными in vitro и результатами, полученными на экстрактах яиц Xenopus.

Титановый фонарик Aurora A4 Pro

Возврат
Наш полис действует 14 дней. Если с момента покупки прошло 14 дней, к сожалению, мы не можем предложить вам возврат или обмен.

Гарантия
Период: 2 года
Этапы претензии по гарантии
1. Краткое объяснение проблемы с вашим(и) продуктом(ами)
2. Сделайте фотографии или видео, которые могут четко показать проблему
3. Отправьте электронное письмо по адресу [email protected] com
4. После получения электронного письма мы проверим его и вернемся к вам с решением в течение 48 часов в рабочие дни.

Чтобы иметь право на возврат, ваш товар должен быть неиспользованным и в том же состоянии, в котором вы его получили. Он также должен быть в оригинальной упаковке.

Некоторые виды товаров не подлежат возврату. Скоропортящиеся товары, такие как продукты питания, цветы, газеты или журналы, возврату не подлежат. Мы также не принимаем товары интимного или санитарного назначения, опасные материалы, легковоспламеняющиеся жидкости или газы.

Дополнительные товары, не подлежащие возврату:
Подарочные карты
Загружаемые программные продукты
Некоторые товары для здоровья и личной гигиены

Для оформления возврата нам требуется квитанция или подтверждение покупки.

Пожалуйста, не отправляйте покупку обратно производителю.

Существуют определенные ситуации, когда предоставляется только частичное возмещение (если применимо)
Книга с явными признаками использования его первоначальное состояние повреждено или отсутствуют детали по причинам, не связанным с нашей ошибкой
Любой товар, возвращенный более чем через 30 дней после доставки

Возврат (если применимо)
После получения и проверки вашего возврата мы отправим вам электронное письмо, чтобы уведомить вас о том, что мы получили ваш возвращенный товар.Мы также уведомим вас об одобрении или отклонении вашего возмещения.
Если вы одобрены, ваш возврат будет обработан, и кредит будет автоматически применен к вашей кредитной карте или исходному способу оплаты в течение определенного количества дней.

Задержка или отсутствие возмещения (если применимо)
Если вы еще не получили возмещение, сначала проверьте свой банковский счет еще раз.
Затем свяжитесь с компанией, выпустившей вашу кредитную карту, может пройти некоторое время, прежде чем ваш возврат будет официально отправлен.
Далее обратитесь в свой банк. Часто перед отправкой возмещения требуется некоторое время на обработку.
Если вы сделали все это, но до сих пор не получили возмещение, свяжитесь с нами по адресу [email protected]

Предметы со скидкой (если применимо)
Возврат возможен только за товары по обычной цене, к сожалению, возврат за товары со скидкой невозможен.

Обмен (если применимо)
Мы не принимаем обмены после отправки вашего заказа(ов).

Подарки
Если товар был помечен как подарок при покупке и доставке непосредственно вам, вы получите подарочный кредит на сумму вашего возврата.После получения возвращенного товара вам будет отправлен подарочный сертификат.

Если товар не был помечен как подарок при покупке, или даритель отправил заказ себе, чтобы передать вам позже, мы отправим возврат дарителю, и он узнает о вашем возврате.

Доставка
Чтобы вернуть товар, отправьте его по почте по адресу: Rm., 702, ZongTai Future City, #2007, BaoYuan Rd., Bao’An District, Shenzhen, China

Вы будете нести ответственность за оплату транспортных расходов по возврату вашего товара.Стоимость доставки не возвращается. Если вы получите возмещение, стоимость обратной доставки будет вычтена из вашего возмещения.

В зависимости от того, где вы живете, время, которое может потребоваться для того, чтобы ваш замененный товар был доставлен к вам, может варьироваться.

Если вы отправляете товар стоимостью более 75 долларов США, вам следует рассмотреть возможность использования отслеживаемой службы доставки или приобретения страховки доставки. Мы не гарантируем, что получим ваш возвращенный товар.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.