Сопротивление первичной обмотки: Подключаем к сети неизвестный трансформатор. — Начинающим — Теория

Содержание

Сопротивление обмотки трансформатора 220в. Определение характеристик силового трансформатора без маркировки. Измерение тока холостого хода

Прежде чем подключать трансформатор к сети,нужно определить первичную обмотку трансформатора, прозвонить его первичные и вторичные обмотки омметром.

У понижающих трансформаторов сопротивление сетевой обмотки намного больше, чем сопротивление вторичных обмоток и может отличаться в сто раз.

несколько первичных обмоток

Первичных (сетевых) обмоток может быть несколько, либо единственная обмотка может иметь отводы, если трансформатор универсальный и рассчитан на использование при разных напряжениях сети.

В двух каркасных трансформаторах на стержневых магнитопроводах, первичные обмотки распределены по обоим каркасам.

защищен предохранителем

При пробном включении трансформаторов можно воспользоваться приведённой схемой. При неправильном , предохранитель FU защитит сеть от короткого замыкания, а трансформатор от повреждения.

Видео: Простой способ диагностики силового трансформатор

Когда неизвестен тип силового трансформатора, тем более мы не знаем его паспортных данных, на помощь приходит обыкновенный стрелочный тестер и не хитрое приспособление в лице лампы накаливания.

Как подобрать предохранитель для трансформатора

Рассчитываем ток предохранителя обычным способом:

I – ток, на который рассчитан предохранитель (Ампер),
P – габаритная мощность трансформатора (Ватт),
U – напряжение сети (~220 Вольт).

35 / 220 = 0,16 Ампер

Ближайшее значение – 0,25 Ампер.

определение первичного напряжения трансформатора

Схема измерения тока Холостого Хода (ХХ) трансформатора. Ток ХХ трансформатора обычно замеряют, чтобы исключить наличие короткозамкнутых витков или убедится в правильности подключения первичной обмотки.

При замере тока ХХ, нужно плавно поднимать напряжение питания. При этом ток должен плавно возрастать. Когда напряжение превысит 230 Вольт, ток обычно начинает возрастать более резко.

Если ток начинает резко возрастать при напряжении значительно меньшем, чем 220 Вольт, значит, либо Вы неправильно выбрали первичную обмотку, либо она неисправна.

Мощность (Вт) Ток ХХ (мА)
5 — 10 10 — 200
10 -50 20 — 100
50 — 150 50 — 300
150 — 300 100 — 500
300 — 1000 200 — 1000

Ориентировочные токи ХХ трансформаторов в зависимости от мощности.
Нужно добавить, что токи ХХ трансформаторов даже одной и той же габаритной мощности могут очень сильно отличаться. Чем более высокие значения индукции заложены в расчёт, тем больше ток ХХ.

Схема подключения, при определения количества витков на вольт.

Можно подобрать готовый трансформатор из числа унифицированных типа ТН,

ТА, ТНА, ТПП и других. А если Вам необходимо намотать или перемотать
трансформатор под нужное напряжение, что тогда делать?

Тогда необходимо подобрать подходящий по мощности силовой трансформатор
от старого телевизора, к примеру, трансформатор и ему подобные.

Надо четко понимать, что чем больше количества витков в первичной обмотке тем больше её сопротивление и поэтому меньше нагрев и второе, чем толще провод, тем больше можно получить силу тока , но это зависит от размеров сердечника — сможете ли разместить обмотку.

Что делаем далее, если неизвестно количество витков на вольт?

Для этого необходим ЛАТР, мультиметр (тестер) и прибор измеряющий переменный ток —
амперметр. Наматываем по вашему усмотрению обмотку поверх имеющейся,
диаметр провода любой, для удобства можем намотать и просто монтажным
проводом в изоляции.

Формула для расчета витков трансформатора

50/S

Сопутствующие формулы:

P=U2*I2 (мощность трансформатора)

Sсерд(см2)= √ P(ва) N=50/S

I1(a)=P/220 (ток первичной обмотки)

W1=220*N (количество витков первичной обмотки)

W2=U*N (количество витков вторичной обмотки)

D1=0,02*√i1(ma) D2=0,02*√i2(ma)
K=Sокна/(W1*s1+W2*s2)

50/S — это эмпирическая формула, где S — площадь сердечника трансформатора в см2 (ширину х толщину), считается, что она справедлива до мощности порядка 1кВт.
Измерив площадь сердечника, прикидываем сколько надо
витков намотать на 10 вольт, если это не очень трудно, не разбирая
трансформатора наматываем контрольную обмотку через свободное
пространство (щель).

Подключаем лабораторный автотрансформатор к
первичной обмотке и подаёте на неё напряжение, последовательно включаем

контрольный амперметр, постепенно повышаем напряжение ЛАТР-ом, до начала
появления тока холостого хода.

Если вы планируете намотать трансформатор с достаточно
«жёсткой» характеристикой, к примеру, это может быть усилитель мощности
передатчика в режиме SSB, телеграфном, где происходят довольно резкие
броски тока нагрузки при высоком напряжении (2500 -3000 в), например,
тогда ток холостого хода трансформатора устанавливаем порядка 10% от
максимального тока, при максимальной нагрузке трансформатора. Замерив
полученное напряжение, намотанной вторичной контрольной обмотки, делаем
расчет количества витков на вольт.

Пример: входное напряжение 220вольт, измеренное напряжение вторичной обмотки 7,8 вольта, количество витков 14.

Рассчитываем количества витков на вольт
14/7,8=1,8 витка на вольт.

Если нет под рукой амперметра, то вместо него можно использовать

вольтметр, замеряя падение напряжение на резисторе, включенного в разрыв
подачи напряжения к первичной обмотке, потом рассчитать ток из
полученных измерений.

Если такой вопрос предстоит решить бывалому электрику, это не составит для него никакого труда, так как выяснить где начало и конец – это самое легкое, что может для него быть. На самом деле и для опытного человека это, также, не составляет особого труда, необходимо знать основные параметры и конструктивные правила, а также соблюдать технику безопасности, при работе с электрическими приборами и установками, а также с высоковольтным напряжением, чтобы не произошло никаких непредвиденных ситуаций со здоровьем.


Определение первичной и вторичной обмотки трансформаторной установки

Бывает так, что трансформаторная установка на своем корпусе не имеет абсолютно никакие опознавательные знаки, но имеет медные шнуры, которые выступают из четырех выводах.

Одна выводка имеет большой шнур из меди, а другая, тонкий. Человек, который уже сталкивался с таким вопросом, моментально будет уверен в том, что нужно делать. Так как супертонкий шнур – и есть электрообмотка первичного типа, соответственно второй шнур – вторичного типа.

Одним из обязательных указаний есть то, что первичная обмотка подключается только к сети с напряжением 220 вольт и она обматывается тоненьким шнуром из медной основы. Значит, делая вывод, можно сказать, первоначальная обмотка будет исполнена тонким проводом, а также сопротивление у нее 62 Ома. Так как вторичная электрообмотка исполнена толстым шнуром, сопротивление меньше. Вторичная электрообмотка может включать несколько витков, чего не скажешь про первичную, она всегда только одна.

Прежде чем подключать трансформатор к сети,нужно определить первичную обмотку трансформатора, прозвонить его первичные и вторичные обмотки омметром.

У понижающих трансформаторов сопротивление сетевой обмотки намного больше, чем сопротивление вторичных обмоток и может отличаться в сто раз.

несколько первичных обмоток

Первичных (сетевых) обмоток может быть несколько, либо единственная обмотка может иметь отводы, если трансформатор универсальный и рассчитан на использование при разных напряжениях сети.

В двух каркасных трансформаторах на стержневых магнитопроводах, первичные обмотки распределены по обоим каркасам.

защищен предохранителем

При пробном включении трансформаторов можно воспользоваться приведённой схемой. При неправильном , предохранитель FU защитит сеть от короткого замыкания, а трансформатор от повреждения.

Видео: Простой способ диагностики силового трансформатор

Когда неизвестен тип силового трансформатора, тем более мы не знаем его паспортных данных, на помощь приходит обыкновенный стрелочный тестер и не хитрое приспособление в лице лампы накаливания.

Как подобрать предохранитель для трансформатора

Рассчитываем ток предохранителя обычным способом:

I – ток, на который рассчитан предохранитель (Ампер),
P – габаритная мощность трансформатора (Ватт),
U – напряжение сети (~220 Вольт).

35 / 220 = 0,16 Ампер

Ближайшее значение – 0,25 Ампер.

определение первичного напряжения трансформатора

Схема измерения тока Холостого Хода (ХХ) трансформатора. Ток ХХ трансформатора обычно замеряют, чтобы исключить наличие короткозамкнутых витков или убедится в правильности подключения первичной обмотки.

При замере тока ХХ, нужно плавно поднимать напряжение питания. При этом ток должен плавно возрастать. Когда напряжение превысит 230 Вольт, ток обычно начинает возрастать более резко. Если ток начинает резко возрастать при напряжении значительно меньшем, чем 220 Вольт, значит, либо Вы неправильно выбрали первичную обмотку, либо она неисправна.

Мощность (Вт) Ток ХХ (мА)
5 — 10 10 — 200
10 -50 20 — 100
50 — 150 50 — 300
150 — 300 100 — 500
300 — 1000 200 — 1000

Ориентировочные токи ХХ трансформаторов в зависимости от мощности.
Нужно добавить, что токи ХХ трансформаторов даже одной и той же габаритной мощности могут очень сильно отличаться. Чем более высокие значения индукции заложены в расчёт, тем больше ток ХХ.

Схема подключения, при определения количества витков на вольт.

Можно подобрать готовый трансформатор из числа унифицированных типа ТН,
ТА, ТНА, ТПП и других. А если Вам необходимо намотать или перемотать
трансформатор под нужное напряжение, что тогда делать?

Тогда необходимо подобрать подходящий по мощности силовой трансформатор
от старого телевизора, к примеру, трансформатор и ему подобные.

Надо четко понимать, что чем больше количества витков в первичной обмотке тем больше её сопротивление и поэтому меньше нагрев и второе, чем толще провод, тем больше можно получить силу тока , но это зависит от размеров сердечника — сможете ли разместить обмотку.

Что делаем далее, если неизвестно количество витков на вольт?

Для этого необходим ЛАТР, мультиметр (тестер) и прибор измеряющий переменный ток —
амперметр. Наматываем по вашему усмотрению обмотку поверх имеющейся,
диаметр провода любой, для удобства можем намотать и просто монтажным
проводом в изоляции.

Формула для расчета витков трансформатора

50/S

Сопутствующие формулы:

P=U2*I2 (мощность трансформатора)

Sсерд(см2)= √ P(ва) N=50/S

I1(a)=P/220 (ток первичной обмотки)

W1=220*N (количество витков первичной обмотки)

W2=U*N (количество витков вторичной обмотки)

D1=0,02*√i1(ma) D2=0,02*√i2(ma)
K=Sокна/(W1*s1+W2*s2)

50/S — это эмпирическая формула, где S — площадь сердечника трансформатора в см2 (ширину х толщину), считается, что она справедлива до мощности порядка 1кВт.
Измерив площадь сердечника, прикидываем сколько надо
витков намотать на 10 вольт, если это не очень трудно, не разбирая
трансформатора наматываем контрольную обмотку через свободное
пространство (щель).

Подключаем лабораторный автотрансформатор к
первичной обмотке и подаёте на неё напряжение, последовательно включаем
контрольный амперметр, постепенно повышаем напряжение ЛАТР-ом, до начала
появления тока холостого хода.

Если вы планируете намотать трансформатор с достаточно
«жёсткой» характеристикой, к примеру, это может быть усилитель мощности
передатчика в режиме SSB, телеграфном, где происходят довольно резкие
броски тока нагрузки при высоком напряжении (2500 -3000 в), например,
тогда ток холостого хода трансформатора устанавливаем порядка 10% от
максимального тока, при максимальной нагрузке трансформатора. Замерив
полученное напряжение, намотанной вторичной контрольной обмотки, делаем
расчет количества витков на вольт.

Пример: входное напряжение 220вольт, измеренное напряжение вторичной обмотки 7,8 вольта, количество витков 14.

Рассчитываем количества витков на вольт
14/7,8=1,8 витка на вольт.

Если нет под рукой амперметра, то вместо него можно использовать
вольтметр, замеряя падение напряжение на резисторе, включенного в разрыв
подачи напряжения к первичной обмотке, потом рассчитать ток из
полученных измерений.

Первичная обмотка трансформатора – это часть устройства, к которой подводится преобразуемый переменный ток. Определить, где первичная, а где вторичная обмотка трансформатора, важно при использовании устройств без заводской маркировки и самодельных катушек.

На самодельных трансформаторах нет обозначений первичной обмотки.

Знания о внутреннем строении и принципе действия трансформаторов имеют практическое значение для начинающих радиолюбителей и домашних мастеров. Имея информацию о типах обмоток, методах их расчета и главных отличиях, можно с большей уверенностью начинать создание систем освещения и прочих устройств.

Типы трансформаторных обмоток

В зависимости от взаиморасположения проводящих ток элементов, направления их намотки и формы сечения провода выделяют несколько типов обмоток трансформаторов:

  1. Однослойная или двухслойная цилиндрическая обмотка из прямоугольного провода. Технология ее изготовления очень проста, благодаря чему такие катушки получили широкое распространение. Обмотка имеет небольшую толщину, что уменьшает нагрев устройства. Из недостатков следует выделить небольшую прочность конструкции.
  2. Многослойная цилиндрическая обмотка является аналогом предыдущего типа, но провод расположен в несколько слоев. Окна магнитной системы при этом заполняются лучше, но появляется проблема перегрева.
  3. Цилиндрическая многослойная обмотка из провода круглого сечения обладает свойствами, близкими к предыдущим разновидностям обмоток, но к недостаткам добавляется утрата прочности по мере роста мощности.
  4. Винтовая обмотка с одним, двумя и больше ходами имеет высокую прочность, отличную изоляцию и охлаждение. По сравнению с цилиндрическими обмотками, винтовая обходится дороже в производстве.
  5. Непрерывная обмотка из провода прямоугольного сечения не перегревается, она обладает значительным запасом прочности.
  6. Многослойная обмотка из фольги устойчива к повреждениям, хорошо заполняет окно магнитной системы, но технология производства таких катушек сложная и дорогостоящая.

У трансформаторов есть шесть основных типов обмотки.

На схемах трансформаторов начало обмоток высокого напряжения обозначается большими буквами латинского алфавита (A, B, C), а такая же часть проводов низкого напряжения – строчными буквами. Противоположный конец обмотки имеет общепринятое условное обозначение, состоящее из конечных трех букв латинского алфавита – X, Y, Z для входящего напряжения и x, y, z для выходящего.

Различают обмотки и по назначению:

  • основные – к ним относятся первичная и вторичная обмотки, по которым ток подается из сети и поступает к месту потребления;
  • регулирующие – являют собой отводы, главная функция которых – изменение коэффициента трансформации напряжения;
  • вспомогательные – используются для обеспечения нужд самого трансформатора.

Автоматизированный расчет намотки трансформатора

Правильно выбрать трансформатор важно не только при проведении ремонта электрической сети, систем освещения и цепей управления. Расчет важен и для радиолюбителей, которые хотят самостоятельно изготовить катушку для конструируемого прибора.

Для этого существуют удобные программы-калькуляторы, которые обладают широким функционалом и оперируют различными методами расчета.

Специальные программы облегчат расчет траснформатора.

  • напряжение, подающееся на первичную обмотку катушки, в большинстве случаев это для домашних нужд
  • напряжение составляет 220 вольт;
  • напряжение на вторичной обмотке;
  • сила тока вторичной обмотки.

Результат расчетов представлен в виде удобной таблицы, в которой указаны такие значения, как параметры сердечника и высота стержня, сечение провода, количество витков и мощность обмоток.

Автоматизированный расчет сильно упрощает теоретическую часть процесса конструирования трансформатора, позволяя сосредоточиться на важных деталях.

Отличия первичной обмотки от вторичной

Определить тип обмотки можно по ее сопротивлению.

Определение типа обмотки может быть важным в тех случаях, когда на трансформаторе не сохранилось никаких обозначений. Как узнать, где первичная, а где вторичная обмотка? Они рассчитаны на разное напряжение. Если к сети в 220 В подключить вторичную обмотку, то устройство просто сгорит.

Главный визуальный критерий, при помощи которого можно определить тип обмотки, – толщина провода, припаянного к его выводам . Трансформатор имеет 4 выхода: два для подключения к сети, а еще два для вывода напряжения. Провода, которыми первичная обмотка соединяется с сетью, имеют небольшую толщину. Вторичная обмотка подключена проводами довольно большого поперечного сечения.

Еще один верный признак, позволяющий узнать тип обмотки, – измерение сопротивления провода. Сопротивление первичной обмотки имеет довольно высокое значение тогда, когда у вторичной оно может составлять до 1 Ома.

Вне зависимости от модели, первичная обмотка трансформатора всегда будет одна. На принципиальных схемах она обозначается римской цифрой I. Вторичных обмоток может быть несколько, их обозначение – II, III, IV, и т.д. Не стоит допускать распространенной ошибки, называя такие обмотки третичными, четвертичными и так далее. Все они имеют один ранг и называются вторичными.

Какие функции выполняет трансформатор?

Трансформаторы широко используются в зарядных устройствах.

Главная функция трансформаторов состоит в понижении или повышении напряжения подаваемого на них тока. Эти устройства находят широкое применение в высоковольтных сетях, которые доставляют электричество от места его выработки до конечного потребителя.

В современном домашнем хозяйстве трудно обойтись без трансформатора тока. Данные устройства используются во всех типах техники, начиная от холодильника и заканчивая компьютером.

Еще недавно размеры и вес бытовой техники часто определялись именно параметрами трансформатора, ведь основное правило заключалось в том, что чем выше мощность преобразователя тока, тем он больше и тяжелее. Чтобы увидеть это, достаточно просто сравнить между собой два типа зарядных устройств. Трансформаторы от старого мобильного телефона и современного смартфона или планшета. В первом случае перед нами будет небольшое, но увесистое приспособление для зарядки, которое заметно греется и часто выходит из строя. Импульсные трансформаторы отличаются бесшумной работой, компактностью и высокой надежностью. Принцип их действия заключается в том, что переменное напряжение сначала поступает на выпрямитель и преобразовывается в высокочастотные импульсы, которые подаются на небольшой трансформатор.

В условиях проведения ремонта техники дома часто возникает потребность самостоятельной намотки катушки трансформатора. Для этого используют сборные сердечники, которые состоят из отдельных пластин. Детали соединяются между собой посредством замка, образовывая жесткую конструкцию. Обмотка проводом производится при помощи самодельного устройства, которое работает по принципу коловорота.

Создавая такой трансформатор, следует помнить: чем плотнее и аккуратнее намотана проволока, тем меньше проблем будет возникать с эксплуатацией такого устройства.

Витки отделяются друг от друга одинарным слоем бумаги, промазанной клеем, а первичная обмотка отделяется от вторичной промежутком из 4-5 слоев бумаги. Такая изоляция обеспечит защиту от пробоев и короткого замыкания. Правильно собранный трансформатор гарантирует стабильность работы техники, отсутствие назойливого гула и перегревов.

Заключение по теме

Трансформаторы используются в большинстве окружающей нас техники. Знание об их внутреннем строении дает возможность при необходимости произвести их ремонт, обслуживание или замену.

Отличить первичную обмотку от вторичной бывает важно для правильного подключения устройства в сеть. Подобная проблема может возникнуть и при использовании самодельных устройств или трансформаторов без маркировки.

Непрерывная катушечная обмотка применяется только при напряжении 110 кВ и выше. При использовании в обмотке нескольких параллельных проводов транспозиция делается, как в винтовых параллельных обмотках.

Трансформаторы применяются практически во всех электроприборах, как промышленных, так и бытовых.

Оставим за рамками статьи трансформаторы, используемые энергетическими компаниями, и рассмотрим устройства преобразования напряжения, применяемые в блоках питания домашних электроприборов.

Как работает трансформатор, и для чего он нужен?

Трансформатор относится к элементарным электротехническим устройствам. Принцип его работы основан на возбуждении магнитного поля и двустороннем его преобразовании.

Важно! Индуцировать магнитное поле на сердечнике можно только с помощью переменного тока. Поэтому трансформаторов, работающих на постоянном токе, не существует. При необходимости преобразовать постоянное напряжение, его сначала делают переменным или импульсным. Например, с помощью задающих генераторов.

На единый магнитный сердечник наматывается первичная обмотка, на которую подается переменное напряжение с первичными характеристиками. На остальных обмотках, намотанных на тот же сердечник, индуцируется переменное напряжение. Разница в количестве витков в отношении к первичке, определяет коэффициент передачи.

Как рассчитать обмотку трансформатора?

Например, первичка состоит из 2200 витков и на нее подается 220 вольт переменного напряжения. На каждые 10 витков такого трансформатора приходится 1 вольт. Соответственно, для получения требуемого значения напряжения на вторичных обмотках, необходимо умножить его на 10, и мы получим количество витков вторички.

Чтобы получить 24 вольта, нам необходимо 240 витков вторичной обмотки. Если требуется с одного трансформатора снимать несколько значений, можно намотать несколько обмоток.
Как проверить трансформатор и определить его обмотки?

Конец одной обмотки часто соединяют с началом следующей. Например, мы имеем две вторички на 240 и на 200 витков, соединенных последовательно. Тогда на I обмотке будет 24 вольта, на II – 20 вольт. А если снять напряжение с крайних выводов – получится 44 вольта.


Следующее значение – максимальная мощность нагрузки. Это неизменная величина. Если первичка рассчитана на мощность 220Вт, значит, через нее можно пропустить ток 1А. Соответственно, при напряжении 20 вольт на вторичной обмотке, рабочий ток может достигать 11А.

Исходя из требуемой мощности, рассчитывается сечение магнитопровода (сердечника) и сечение проводника, из которого наматываются обмотки.

Чтобы понять принцип расчета магнитопровода, взгляните на приложенную таблицу:


Это типовой расчет для Ш образного сердечника, применяемого в большинстве бытовых трансформаторов. Магнитопровод набирается из пластин, выполненных из электротехнической стали или сплавов на основе железа с добавлением никеля. Такой материал отлично справляется с удержанием стабильного магнитного поля.

Сопротивление — первичная обмотка — трансформатор

Сопротивление — первичная обмотка — трансформатор

Cтраница 2

Если с помощью обычного омметра измерить сопротивление первичной обмотки трансформатора звонка, то его величина окажется равной примерно 250 ом. Если напряжение сети равно, например, 127 в, то, используя закон Ома, можно определить ток, который, по-видимому, должен протекать через первичную обмотку трансформатора. Такой расчет показывает, что ток через первичную обмотку должен быть равен примерно 0 5 а.  [16]

Коэффициент усиления на низших частотах уменьшается из-за уменьшения сопротивления первичной обмотки трансформатора. Искажения, вносимые трансформатором в области верхних частот, обусловлены наличием магнитного потока, который не охватывает все витки как первичной, так и вторичной обмоток — потока рассеяния. На низких частотах он практически не влияет на работу усилителя, а на верхних частотах уменьшает коэффициент усиления. Неправильная конструкция или неисправность выходного трансформатора могут быть причиной уменьшения мощности и появления недопустимых частотных и нелинейных искажений.  [17]

Здесь гг — сопротивление половины вторичной обмотки трансформатора; г — сопротивление первичной обмотки трансформатора, приведенное ко вторичной обмотке.  [18]

Если сопротивление питающей сети поддается оценке, его следует прибавить к сопротивлению первичной обмотки трансформатора.  [19]

Такое же напряжение должен давать и источник анодного питания, так как сопротивление первичной обмотки трансформатора постоянному току достаточно мало в сравнении с внутренним сопротивлением лампы постоянному току.  [21]

Сопротивления Rl и 2 поддерживающей жидкости между двумя парами следящих электродов вместе с сопротивлениями первичной обмотки трансформатора составляют плечи моста. Диагональю его служит вспомогательная обмотка Рг ведущего двигателя и включенный последовательно с ней конденсатор С.  [23]

В ППН с бестрансформаторной обратной связью также используется мультивибратор, но коллекторными нагрузками его транзисторов являются сопротивления первичных обмоток трансформатора и отсутствуют тиристоры.  [25]

Напряжение на выходе разностного трансформатора определяется апериодической составляющей в дифференциальном токе; данное положение справедливо, если сопротивление первичной обмотки трансформатора берется относительно небольшим, а сам трансформатор работает при небольших величинах магнитной индукции.  [26]

Трансформаторный усилитель с последовательным включением трансформатора отличается от усилителя с емкостными связями тем, что коллектор транзистора подключается непосредственно к отрицательному полюсу источника питания Ек постоянного тока, так как сопротивление первичной обмотки трансформатора постоянному току мало. При параллельном включении трансформатора его первичная обмотка имеет переходный конденсатор С2, не пропускающий постоянную составляющую тока.  [27]

В каскадах с трансформаторной связью ( см. рис. 7 — 4) угол наклона нагрузочной характеристики по переменному току, как правило, значительно меньше, чем у соответствующей характеристики по постоянному току, так как сопротивление первичной обмотки трансформатора по постоянному току ( ri) обычно невелико.  [28]

В среднем положении движка переменного резистора 4R11, когда напряжение, создаваемое катодцым током лампы ЗЛЗ на резисторах 4R11 и 4R1 & ( примерно 2 В) равно напряжению, создаваемому коллекторным током транзистора ЗТ4 на омическим сопротивлении первичной обмотки трансформатора ЗТрЗм аостойндай ток через кадровые отклоняющие катушки не протекает. Перемещение движка переменного резистора 4R11 вправо или влево от среднего положения ( см. рис. 7.8) вызывает появление постоянного тока в кадровых отклоняющих катушках, что позволяет смещать растр вверх или вниз. Конденсатор ЗС47 блокирует кадровые импульсы на корпус.  [29]

Страницы:      1    2    3    4

10.1. Конструкция трансформатора

      Трансформатор представляет собой электромагнитный аппарат, предназначенный для преобразования величин токов и напряжений без изменения частоты.
    Трансформатор  состоит из  замкнутого  ферромагнитного  сердечника, на котором размещены две или большее число обмоток. Обмотка, подключенная к источнику энергии, называется первичной. Обмотки, подключенные к сопротивлениям нагрузки, называются вторичными.
  Сердечник (магнитопровод) трансформатора изготавливают из листовой электротехнической стали, имеющей малые потери на перемагничивание и на вихревые токи. Отдельные листы стали изолируют слоем лака, после чего стягивают болтами. Такое устройство применяется для уменьшения вихревых токов, индуктируемых в стали переменным потоком.
    По конструкции  сердечника различают два типа трансформатора: броневые и стержневые. На рис. 10.1  изображен   броневой трансформатор,  или  трансформатор  с   Ш-образным сердечником, а на рис. 10.2 — стержневой трансформатор с П-образным сердечником.

  Рис. 10.1                          Рис. 10.2                    

10.2. Работа трансформатора в режиме холостого хода

       Под холостым ходом трансформатора понимается режим его работы при разомкнутой вторичной обмотке.
       Первичная обмотка трансформатора подключена к источнику переменного напряжения. Ток i первичной обмотки создает переменное магнитное поле, намагничивающее сердечник трансформатора.
       Магнитный поток в трансформаторе разделим на две части: основной магнитный поток Ф, замыкающийся в сердечнике, и поток рассеяния Ф1S, замыкающийся частично по воздуху.
       На рис. 10.3 изображен трансформатор, работающий в режиме холостого хода.

  Рис. 10.3

       W1 — число витков первичной обмотки;
       W2— число витков вторичной обмотки;
       R1 — активное сопротивление первичной обмотки.

     Определим ЭДС, индуктированную в первичной обмотке трансформатора основным магнитным потоком.

.

       Основной магнитный поток изменяется по синусоидальному закону

,


       где  Фm — максимальное или амплитудное значение основного магнит-ного потока;
              ω = 2πf — угловая частота;
              f — частота переменного напряжения.

       Мгновенное значение ЭДС

.


       Максимальное значение

.


        Действующее значение ЭДС в первичной обмотке

.


        Для вторичной обмотки можно получить аналогичную формулу

.

        Электродвижущие силы E1 и E2, индуктированные в обмотках трансформатора основным магнитным потоком, называются трансформаторными ЭДС. Трансформаторные ЭДС отстают по фазе от основного магнитного потока на 90°.
        Магнитный поток рассеяния индуктирует в первичной обмотке ЭДС рассеяния

,

        где  L1s — индуктивность рассеяния в первичной обмотке.
        Запишем уравнение по второму закону Кирхгофа для первичной обмотки

,

откуда

.      (10.1)


        Напряжение на первичной катушке имеет три слагаемых: падение напряжения, напряжение, уравновешивающее трансформаторную ЭДС, напряжение, уравновешивающее ЭДС рассеяния.
        Запишем уравнение (10.1) в комплексной форме

.     (10.2)


        где   индуктивное сопротивление рассеяния первичной обмотки.

        На рис. 10.4 изображена векторная диаграмма трансформатора, работающего в режиме холостого хода.

     Векторы трансформаторных ЭДС и отстают на 90° от вектора основного магнитного потока . Вектор напряжения параллелен вектору тока , а вектор опережает вектор тока на 90°. Вектор напряжения на зажимах первичной обмотки трансформатора равен геометрической сумме векторов — , ,             Рис. 10.4         .

     На рис. 10.5  изображена схема  замещения трансформатора,  соответствующая уравнению (10.2).

     XЭ — индуктивное сопротивление, пропорциональное реактивной мощности, затрачиваемой на создание основного магнитного потока.
     В режиме холостого хода        .
     Коэффициент трансформации     .

                 Рис. 10.5

         Коэффициент трансформации экспериментально определяется из опыта холостого хода.

10.3. Работа трансформатора под нагрузкой

       Если к первичной обмотке трансформатора подключить напряжение U1, а вторичную обмотку соединить с нагрузкой, в обмотках появятся токи I1 и I2. Эти токи создадут магнитные потоки Ф1 и Ф2, направленные навстречу друг другу. Суммарный магнитный поток в магнитопроводе уменьшается. Вследствие этого индуктированные суммарным потоком ЭДС E1 и E2 уменьшаются. Действующее значение напряжения U1 остается неизменным. Уменьшение E1, согласно (10.2), вызывает увеличение тока токи I1. При увеличении тока I1 поток Ф1 увеличивается ровно настолько, чтобы скомпенсировать размагничивающее действие потока Ф2. Вновь восстанавливается равновесие при практически прежнем значении суммарного потока.
       В нагруженном трансформаторе, кроме основного магнитного потока, имеются потоки рассеяния Ф1S и Ф2S, замыкающиеся частично по воздуху. Эти потоки индуктируют в первичной и вторичной обмотках ЭДС рассеяния.

,     ,

       где   X2S — индуктивное сопротивление рассеяния вторичной обмотки.
       Для первичной обмотки можно записать уравнение

.     (10.3)

       Для вторичной обмотки

,     (10.4)

       где  R2 — активное сопротивление вторичной обмотки;
              ZН — сопротивление нагрузки.
       Основной магнитный поток трансформатора есть результат совместного действия магнитодвижущих сил первичной и вторичной обмоток.

.

   Трансформаторная ЭДС E1, пропорциональная основному магнитному потоку, приблизительно равна напряжению на первичной катушке U1. Действующее значение напряжения постоянно. Поэтому основной магнитный поток трансформатора остается неизменным при изменении сопротивления нагрузки от нуля до бесконечности.
       Если  , то и сумма магнитодвижущих сил трансформатора

.     (10.5)

       Уравнение (10.5) называется уравнением равновесия магнитодвижущих сил.
       Уравнения (10.3), (10.4), (10.5) называются основными уравнениями трансформатора.
       Из уравнения (10.5) получим формулу

.     (10.6)

       Согласно формуле (10.6), ток в первичной обмотке складывается из тока холостого хода, или намагничивающего тока, и тока, компенсирующего размагничивающее действие вторичной обмотки.
       Умножим левую и правую части уравнения (10.4) на коэффициент трансформации KT

.      (10.7)

       где   приведенное активное сопротивление вторичной обмотки;

               приведенное индуктивное сопротивление вторичной обмотки;

               приведенное напряжение на нагрузке;

               приведенное сопротивление нагрузки.
       Величиной намагничивающего тока можно пренебречь, так как она мала по сравнению с током первичной обмотки трансформатора в нагрузочном режиме , тогда .
       Подставим уравнение (10.7) в уравнение (10.3).
       Получим

.     (10.8)

       Уравнению (10.8) соответствует упрощенная схема замещения трансформатора, изображенная на рис. 10.6.


Рис. 10.6

        активное сопротивление короткого замыкания трансформатора,

       индуктивное сопротивление короткого замыкания.

       Параметры упрощенной схемы замещения определяются из опыта короткого замыкания. Для этого собирается схема рис. 10.7.


Рис. 10.7

       Зажимы вторичной обмотки замыкаются накоротко. Измеряют напряжение, ток и мощность: U1k, I1k, Pk. Опыт короткого замыкания осуществляется при пониженном напряжении на первичной обмотке.
       Затем вычисляют

.

       где  ZK — полное сопротивление короткого замыкания.

       На рис. 10.8 изображена векторная диаграмма трансформатора, соответствующая упрощенной схеме замещения. Нагрузкой трансформатора является активное сопротивление RH.
       Вектор тока совмещен с вещественной осью комплексной плоскости.

             Рис. 10.8
       Вектор напряжения на сопротивлении нагрузки совпадает с вектором тока по направлению. Вектор напряжения на индуктивном сопротивлении перпендикулярен, а вектор напряжения параллелен вектору тока. Вектор напряжения на входе трансформатора равен сумме трех векторов напряжения.
       Упрощенная схема используется для расчета цепей, содержащих трансформаторы.

10.4. Специальные типы трансформаторов

     Наиболее  часто в  электротехнических   установках используются следующие  специальные типы трансформаторов: автотрансформаторы, многообмоточные и трехфазные трансформаторы.
       Автотрансформатором называется такой трансформатор, у которого имеется только одна обмотка, часть которой принадлежит одновременно вторичной и первичной цепям. Схема однофазного трансформатора изображена на рис. 10.9.

       Режим холостого хода автотрансформатора, когда I2 = 0, ничем не отличается от режима холостого хода обычного трансформатора.
       Подводимое к трансформатору напряжение U1 = UAB равномерно распределяется между витками первичной обмотки.

              Рис. 10.9

       Вторичное напряжение

       где  коэффициент трансформации.        Автотрансформаторы выгодно использовать в тех случаях, когда коэффициент трансформации близок к единице.
       Многообмоточные (одна первичная и несколько вторичных) трансформаторы используются в радиотехнических схемах для получения нескольких напряжений.
       В режиме холостого хода работа таких трансформаторов не отличается от двухобмоточных.
       В трехфазной сети переменного тока преобразование напряжений осуществляется с помощью трехфазного трансформатора с общим для трех фаз сердечником. В трехфазном трансформаторе с общим магнитопроводом магнитный поток любой из фаз может замыкаться через стержни, на которых расположены обмотки двух других фаз. Затраты стали на трехфазный трансформатор значительно меньше, чем на три однофазных трансформатора.

Реактивное сопротивление трансформатора. Импеданс трансформатора

Когда на трансформатор подается нагрузка, в его обмотках возникают магнитные потоки. Большая часть из них проходит через обе обмотки. Но есть малая часть потоков, которые замыкаются только на одной из обмоток. Последняя часть рассеивается. Этот поток называется реактивным потоком рассеяния.

Наглядно это явление видно на рисунке:

 

Что такое сопротивление трансформатора?

Обмотки трансформаторов изготавливаются из проводящего материала – меди либо алюминия. Оба металла неплохо проводят электрический ток. Но идеальных проводников просто не существует. Поэтому в обеих обмотках есть определенное сопротивление. Из него и складывается сопротивление трансформатора.

Импеданс трансформатора

Мы выяснили, что в катушках трансформатора есть сопротивление и реактивное сопротивление. Совокупность внутреннего сопротивления и сопротивления рассеивания – это и есть импеданс трансформатора.

Магнитный поток рассеяния в трансформаторах

Если бы существовал идеальный трансформатор, то все магнитные потоки проходили бы через обе обмотки и сердечник. Но на деле такого просто не бывает. Часть магнитного потока выходит из обмотки, проходит через изоляцию и замыкается в этой же обмотке. Это явление называют реактивным сопротивлением рассеяния обмоток. Оно же является реактивным сопротивлением рассеяния всего трансформатора. Иначе его еще называют рассеянием магнитного потока. 

Как рассчитать импеданс трансформатора?

Формулы для расчета импеданса трансформатора для обеих обмоток имеют вид:

Z1 = R1 + jX1 и

Z2 = R2 + jX2,

где R1 и R2 – это сопротивление первичной и вторичной обмотки, X1 и X2 – сопротивление рассеяния обмоток, а Z1 и Z2 – это импеданс обмоток.

Как рассчитать напряжение трансформатора с учетом импеданса обмоток?

Из-за сопротивления рассеяния в обмотках возникают перепады напряжения. Если мы подаем на первичную обмотку ток напряжением V1, то из-за сопротивления рассеяния в ней возникает составляющая I1X1 как самоиндукция. X1 здесь – это реактивное сопротивление рассеяния. Теперь, если учтем падение напряжения из-за сопротивления на первичной обмотке, то уравнение напряжения трансформатора примет вид:

V1 = E1 + I1(R1 + jX1) ⇒ V1 = E1 + I1R1 + jI1X1.

Так же с учетом вторичного реактивного напряжения на вторичной обмотке покажем уравнение напряжения:

V2 = E2 – I2(R2 + jX2) ⇒ V2 = E2 – I2R2 − jI2X2.

Как видите, магнитный поток рассеяния влияет на общее сопротивление трансформатора. Из-за реактивного сопротивления в первичной и вторичной обмотке трансформатора возникают скачки напряжения. Это особенно важно учитывать в электрических сетях, где несколько трансформаторов работают параллельно.

Определение параметров неизвестного трансформатора

Совершенно случайно читателю в руки может попасть старый выходной трансформатор, который, судя по внешнему виду, должен обладать неплохими характеристиками, однако полностью отсутствует информация, что же все-таки скрывается внутри его. К счастью, можно достаточно просто идентифицировать параметры старого выходного трансформатора, имея в распоряжении только цифровой универсальный вольтметр, так как их проектирование всегда следует строго определенным правилам.

Перед тем как приступать к проверке, необходимо зарисовать схему всех имеющихся на трансформаторе внешних соединений и перемычек, а затем удалить их. (Использование цифрового фотоаппарата для этих целей оказывается весьма плодотворным.) Несомненно, первичная обмотка должна иметь отвод от средней точки, чтобы обеспечить возможность использования трансформатора в двухтактной схеме, также на этой обмотке могут быть дополнительные отводы для обеспечения ультралинейного режима работы. Как правило, сопротивление обмотки на постоянном токе, замеряемое омметром между крайними точками обмотки, будет составлять максимальное значение сопротивления среди всех полученных значений и может колебаться от 100 до 300 Ом. Если обнаружена обмотка с подобным значением сопротивления, то, практически во всех случаях, можно считать, что идентифицированы клеммы трансформатора А1 и А2 соответствующие крайним точкам первичной обмотки.

У трансформаторов высокого качества первичная обмотка наматывается симметрично, то есть сопротивления между крайними выводами А1 и А2 и средней точкой высоковольтной обмотки всегда равны, поэтому следующим шагом является определение вывода, для которого сопротивление между ним и выводами А1 и А2 было бы равным половине сопротивления между крайними точками первичной обмотки. Однако более дешевые модели трансформаторов могут оказаться изготовленными не столь тщательно, поэтому сопротивления между двумя половинами обмотки могут не оказаться абсолютно равными между собой.

Так как для изготовления первичной обмотки трансформатора без всяких исключений используется провод одного сечения, то отвод, который расположен на витке, составляющем 20% от общего количества витков между центральным высоковольтным отводом и выводом А1 либо А2, (конфигурация для отбора полной мощности усилителя), будет иметь и сопротивление, составляющее 20% от величины сопротивления между крайним выводом А1 или А2 и центральным отводом первичной обмотки. Если же трансформатор был предназначен для усилителя более высокого качества, то наиболее вероятным расположением этого отвода будет виток, соответствующий 47% сопротивления между этими же точками (конфигурация усилителя мощности, обеспечивающая минимальные искажения).

Вторичная обмотка, скорее всего, также будет иметь четное число выводов, либо будет иметь один отвод. Следует помнить, что в эпоху расцвета электронных ламп сопротивления громкоговорителей составляли либо 15 Ом (громкоговорители высшего качества), либо 4 Ом, поэтому параметры выходных трансформаторов были оптимизированы для этих значений импедансов.

Наиболее распространенным вариантом является использование двух идентичных секций, в которых обмотки используются последовательно включенными для сопротивления громкоговорителей 15 Ом, либо параллельно для сопротивлений 4 Ом (в действительности, 3,75 Ом). Если после того, как определена первичная обмотка трансформатора, обнаружены две обмотки, имеющие сопротивления по постоянному току порядка 0,7 Ом каждая, то, скорее всего, имеется стандартный образец трансформатора.

В трансформаторах высокого качества вышеизложенная идея получила свое дальнейшее развитие, когда вторичную обмотку представляют четыре идентичные секции. Включенные последовательно, они используются для согласования с нагрузкой 15 Ом, однако, будучи все включенными параллельно, они согласуют нагрузку 1 Ом. Это связано не с тем, что были доступны громкоговорители с импедансом 1 Ом (эпоха создания плохих по качеству кроссоверов пока еще не наступила), а с тем, что большая степень секционирования обмотки позволяла получить трансформатор более высокого качества. Поэтому следует искать четыре обмотки с приблизительно одинаковыми сопротивлениями по постоянному току и равными по величине примерно 0,3 Ом. Также необходимо иметь в виду, что помимо того, что контактное сопротивление зонда может составить очень значительную долю при проведении измерений очень малых сопротивлений (что вызывает настоятельную необходимость иметь не только чистый, но и надежный контакт), но также и то, что обычный 41/2 разрядный цифровой вольтметр не обеспечивает достаточной точности при измерениях таких малых значений сопротивлений, поэтому зачастую приходится строить догадки и предположения.

Если после идентификации первичной обмотки установлено, что все остающиеся обмотки оказываются соединенными вместе, то в наличии имеется вторичная обмотка с отводами, наибольшая величина сопротивления которой измеряется между выводами 0 Ом и (допустим) 16 Ом. При условии, что отсутствует отвод обмотки, согласующий сопротивление 8 Ом, то наименьшие значения сопротивления по постоянному току от любого из этих выводов будет являться отводом 4 Ом, а точка с сопротивлением 0 Ом окажется ближайшей к отводу 4 Ом (как правило, во вторичных обмотках с межвитковыми отводами стремятся использовать для отвода 4 Ом более толстый провод). Если же следует ожидать наличия отвода 8 Ом, то идентифицировать отводы следует с использованием метода измерений на переменном токе, который будет описан ниже.

Если назначение некоторых обмоток не удается определить, то, вероятнее всего, они предназначены для обратной связи, возможно действующей на катоды индивидуальных выходных ламп, либо для организации межкаскадной обратной связи.

В любом случае их более точная идентификация может быть проведена позже, так как следующим шагом будет определение коэффициента трансформации, а затем по полученным результатам определение импеданса первичной обмотки трансформатора.

Внимание. Несмотря на то, что при точном выполнении нижеприведенных измерений они не должны представлять опасности для сохранности выходного трансформатора, на выводах трансформатора могут возникнуть представляющие опасность для жизни человека напряжения. Поэтому, если возникают любого рода сомнения относительно имеющегося профессионального опыта, необходимого для выполнения описанных ниже измерений, то следует сразу отказаться от попыток их выполнения.

Выходные трансформаторы ламповых схем предназначены для снижения напряжения с нескольких сотен вольт до десятка вольт в частотном диапазоне от 20 Гц до 20 кГц, поэтому приложение сетевого напряжения к выводам первичной обмотки А1 и А2 не представляет для трансформатора никакой угрозы. При условии, что выводы А1 и А2 были определены правильно, следует подать сетевое напряжение непосредственно на выводы А1 и А2 и измерить напряжение на вторичной обмотке, чтобы определить коэффициент трансформации (или отношение количества витков первичной и вторичной обмоток). Строго говоря, в целях безопасности рекомендуется подавать не сетевое напряжение, а пониженное напряжение от ЛАТРа.

Тестирование трансформатора следует выполнять в следующем порядке:

• установите в сетевой шнур предохранитель с наименьшим из имеющихся значением тока плавкой вставки, например, предохранитель, рассчитанный на ток 3 А, окажется достаточным, но использование предохранителя на 1 А будет предпочтительнее;

• присоедините к сетевой вилке (желательно с заземляющим контактом) три коротких гибких провода. В силу очевидных причин они получили название «провода самоубийцы» и поэтому, когда не используются, должны храниться отдельно и под замком;

• припаяйте луженый наконечник на конец провода, помеченного ярлыком «земля», и привинтите наконечник к металлическому шасси трансформатора, используя специальные зазубренные шайбы, обеспечивающие очень хороший электрический контакт;

• припаяйте фазный провод к выводу А1, а провод нейтрали (нуля) к выводу А2;

• убедитесь, что положение всех соединительных перемычек на вторичной об мотке зарисовано, после чего они все удалены;

• установите вид измерений цифрового вольтметра «переменное напряжение» и подключите его к выводам вторичной обмотки;

• убедившись, что шкала прибора находится в пределах видимости, включите в розетку сетевую вилку. Если на приборе сразу же не появятся результаты измерений, выдернете вилку из розетки. Если прибор фиксирует наличие на-

пряжения во вторичной обмотке, величину которого можно определить, дождитесь стабилизации показаний прибора, запишите полученный результат, выключите сетевое питание и отключите вилку от сетевой розетки;

• проверьте величину сетевого напряжения, для этого подключите цифровой вольтметр к выводам А1 и А2 трансформатора и включите повторно сетевое напряжение. Спишите показания прибора.

После этого можно определить коэффициент трансформации «N», используя следующее простое соотношение между напряжениями:

На первый взгляд эта процедура не покажется очень значительной, но следует помнить, что импедансы пропорциональны квадрату коэффициента трансформации, N2, следовательно, зная величину N можно определить импеданс первичной обмотки, так как уже известен импеданс вторичной.

Пример

Из всех многочисленных проводов у трансформатора имеется пять проводов, которые оказались электрически соединенными между собой (результаты были получены, когда проводились измерения электрического сопротивления с использованием цифрового тестера). Максимальное значение сопротивления между двумя проводами составляет 236 Ом, следовательно, выводы этих проводом могут быть помечены как А1 и А2. После того, как одни щуп цифрового тестера оставался подключенным к выводу А1, было обнаружен второй провод, имеющий сопротивление 110 Ом. Полученное значение достаточно близко к значению сопротивления 118 Ом, чтобы эта точка могла оказаться выводом от центральной точки первичной обмотки трансформатора. Поэтому данную обмотку можно идентифицировать, как высоковольтную обмотку трансформатора. После этого следует переместить один из щупов цифрового тестера к среднему отводу высоковольтной обмотки и измерить сопротивления относительно двух оставшихся выводов. Значение сопротивления для одного вывода составило 29 Ом, а для второго было равно 32 Ом. Учитывая, что (29 Ом : 110 Ом) = 0,26, а (32 Ом: 118 Ом) = 0,27, можно с достаточной уверенностью предположить, что эти выводы используются в качестве ультралинейных отводов для получения максимальной мощности (то есть составляют примерно 20% обмотки). Один из выводов, для которого сопротивление относительно вывода А, имеет меньшее значение, представляет отвод к сетке 2 лампы V1, g2(V1)а второй отвод — к сетке 2 лампы V2, g2(V2)(рис. 5.23).

Вторичная обмотка имеет только две секции, поэтому, скорее всего, они предназначены для подключения нагрузки 4 Ом. Это предположение затем подтверждается измерениями сопротивлений обмоток секций, для первой из них оно составило 0,6 Ом, а для второй 0,8 Ом, что совпадает с типичными значениями для обмоток, предназначенных для согласования нагрузок 4 Ом.

Рис. 5.23 Идентификация обмоток трансформатора с неизвестными параметрами

При подключении трансформатора к сети было зафиксировано сетевое переменное напряжение 252 В, а напряжение на вторичных обмотках составляло 5,60 В. Подставляя полученные значения в формулу для расчета коэффициента трансформации, получим:

Импедансы обмоток изменяются пропорционально N2, поэтому отношение импедансов первичной обмотки к импедансу вторичной составляет 452 = 2025. Так как напряжение на вторичной обмотке измерялось на секции 4 Ом, импеданс первичной обмотки должен составлять (2025 х 4 Ом) = 8100 Ом. Такой результат является вполне допустимым, так как измерения с использованием сетевого напряжения 252 В и частотой 50 Гц могли сдвинуть рабочую точку ближе к области насыщения, что привело к погрешностям определения параметров, Поэтому полученное значение можно округлить до 8 кОм.

Далее необходимо определить начало и конец обмоток каждой из секций вторичной обмотки трансформатора. Это выполняется подключением только одного провода между одной и второй секциями, включая, таким образом, обмотки секций последовательно. После подачи напряжения на первичную обмотку, получим удвоенное значение напряжения на вторичной обмотке, по сравнению с индивидуальным напряжением на каждой. То есть напряжения двух секций дополняют друг друга и следовательно, подключенными оказались конец обмотки первой секции к началу обмотки второй, поэтому можно обозначить вывод секции, где кончается соединительный провод, как « + », а другой конец, как «—». Однако в случае, если напряжение на вторичной обмотке будет отсутствовать, то это будет означать что обмотки в двух секциях включены встречно друг другу, поэтому оба вывода можно будет обозначить, либо как « + », либо как «—».

После того, как все идентичные по характеристикам секции были определены, и для них определены точки начала обмоток, могут измеряться напряжения на всех оставшихся обмотках, быть определены для них коэффициенты трансформации, либо относительно первичной обмотки, либо относительно вторичной, в зависимости от того, какой способ окажется удобнее. Начиная с этого момента наиболее удобным оказывается использование схемы с кратким пометками, так, например, получение двукратного увеличения напряжения вторичной обмотки является очень показательным, так как этот факт может означать либо наличие секции с отводом от средней точки, либо отводы 4 Ом и 16 Ом.

Основные причины выхода из строя трансформаторов, в тракте звуковых частот

Трансформаторы относятся к электронным компонентам с наиболее длительным сроком службы, достигающим 40 и более лет. Все же иногда они могут выходить из строя. Обмотки трансформатора выполняются из провода, который может выходить из строя при протекании через него слишком высоких токов, а изоляция провода может оказаться пробитой, если напряжения, приложенные к обмоткам, превысят допустимые значения.

Наиболее частым случаем, при котором отказывают выходные трансформаторы, является такой, когда он вынужден работать на усилитель в режиме перегрузки. Это может произойти в двухтактном усилителе, когда одна выходная лампа полностью отключена (например, вышла из строя), а вторая работает с явной перегрузкой. Индуктивность рассеяния той половины трансформатора, которая должна пропускать ток отключенной лампы, стремиться поддерживать ток этой половины обмотки неизменным, что влечет за собой появление значительных перенапряжений в первичной обмотке (прежде всего за счет ЭДС самоиндукции), приводящих к пробою межвитковой изоляции. Процесс изменения напряжения на индуктивной обмотке во времени, характеризуется следующим дифференциальным уравнением:

Так как при разрыве тока, его производная стремится к бесконечности di/dt ≈ ∞, возникающая ЭДС самоиндукции развивает напряжение на полуобмотке в цепи вышедшей из строя лампы, значительно превышающее значение высоковольтного источника питания, которое способно легко пробить межвитковую изоляцию.

Также пробой изоляции может быть вызван неправильными условиями эксплуатации аппаратуры. Так. например, если в трансформатор проникла влага, то изоляция (в качестве которой чаще всего используется специальная бумага) становится более проводящей, что значительно увеличивает вероятность ее пробоя.

Также существует опасность выхода из строя выходного трансформатора в случае работы усилителя на громкоговорители, сопротивление которых значительно ниже необходимого. В этом случае, при больших уровнях громкости, токи, текущие через обмотки трансформатора, могут оказаться существенно превышенными.

Еще одна специфическая проблема в ряде случаев возникает в не очень качественных усилителях, например таких, которые одно время широко применялись для электрогитар. В силу того, что скорость нарастания тока при перегрузке очень высока, а качество выходного трансформатора, используемого в усилителях для электрогитар, как правило, не очень хорошее, то высокие значения индуктивности рассеяния могут привести к возникновению таких высоких значений напряжений (эдс самоиндукции) на обмотках, что не исключается возникновение внешней электрической дуги. При этом сам трансформатор мог быть спроектирован таким образом, чтобы благополучно выдержать подобное случайное перенапряжение. Напряжение, необходимое для возникновения электрической дуги, в некоторой степени зависит от степени загрязнения пути, по которому она развивается, поэтому загрязнения (особенно проводящие) снижают это дуговое напряжение. Именно поэтому углеродные следы, остающиеся от прежних дуговых процессов, несомненно, приводят к снижению напряжения, необходимого для возникновения нового дугового процесса.

Несмотря на то, что для развития дуги необходимы высокие напряжения, однажды возникнув, она может поддерживаться гораздо более низкими напряжений. Например, ксеноновая лампа, используемая в небольшом кинопроекторе, должна возбуждаться разрядом конденсатора, заряженным до нескольких сотен вольт, однако после возникновения разряда для поддержания электрической дуги необходимо напряжение всего 26 В и ток 75 А. Если в усилителе возникает электрическая дуга от анода, то путь ее развития всегда связан с точкой, имеющей очень низкое сопротивление относительно земли, так как высокое значение сопротивления, например, резистора сеточного смещения, либо катодного резистора, будет ограничивать величину тока, приводя к гашению дуги. Выводы подогревателей ламп непосредственно связаны с землей через центральный отвод низковольтной обмотки, поэтому наиболее вероятным местом для развития дуги является промежуток между анодом и выводами подогревателей электронных ламп, так как единственным ограничивающим фактором является сопротивление источника низковольтного напряжения.

Если известно, что усилитель может оказаться подверженным высоковольтным разрядам и дуговым процессам, то возможным решением проблемы (в зависимости от типа усилителя) будет включение в схему резистора, гасящего возникающую дугу, на участке между центральным отводом низковольтного (накального) источника и точкой нулевого потенциала высоковольтного источника. Например, использование (проволочного) резистора марки W/Wcсопротивлением 4,7 кОм и мощностью 6 Вт. Однако «плавающий» низковольтный источник питания может в этом случае вызвать возникновение проблем, связанных с фоновыми шумами сети питания, в частности, из-за плохого качества спиралей накала (разводка, изолирующая обмазка, замыкания на шасси).

Рассмотрим и некоторые другие механизмы повреждения трансформаторов.

Слишком большой ток, проходящий через выходную лампу, может вызвать температурный уход эмиссии сетки, расплавление внутренних элементов конструкции лампы, вызывая прохождение тока чрезмерной силы через выходной трансформатор, приводящий к повреждению первичной обмотки. Простейший способ избавиться от данной проблемы, это визуальное наблюдение за усилителем. Если анод лампы становится вишнево-красным, необходимо немедленно выключить усилитель. Выходные каскады ламповых усилителей очень редко оснащаются плавкими предохранителями, отчасти из-за того, что нелинейный характер сопротивления плавкого предохранителя может вызвать дополнительные искажения, но часто также и из-за того, плавкий предохранитель не успевает перегреть достаточно быстро, чтобы успеть защитить выходные лампы.

В отличие от выходных, слаботочные входные и междукаскадные трансформаторы обычно повреждаются механически. Они весьма хрупкие, к тому же они наматываются очень тонким проводом, который легко рвется. В силу этого они требуют очень аккуратного обращения.

Трансформаторы, помещенные в экраны из магнитных материалов (например, из так называемого мю-металла), требуют очень осторожного обращения, их нельзя ронять, так как сильные механические воздействия нарушают доменную структуру магнитного материала, заметно снижая эффективность такого экрана. Например, на разделительном трансформаторе производства корпорации БиБиСи, предназначенном для работы с уровнями сигналов —45дБ, имелось специальное предупреждение на экранирующем кожухе, специально предостерегающее от приложения к нему механических воздействий.

Материалы магнитных сердечников могут деградировать со временем (это, например, оказалось причиной повреждений во время складского хранения силового трансформатора контрольного монитора), а автору совсем недавно довелось увидеть ряд дросселей и трансформаторов, отклонения характеристик которых от нормы могли быть объяснены только некачественным материалом магнитных сердечников. Это соображение всегда должно незримо присутствовать при выборе, который необходимо сделать между запасной частью, предусмотренной регламентом выполнения работ, либо немного более дорогой, но только что изготовленной.

 

Сопротивление первичной обмотки трансформатора микроволновой печи. Как применяют трансформатор от микроволновки

Высоковольтный трансформатор микроволновой печи предназначен для формирования напряжений, необходимых для питания магнетрона. Выбор трансформатора по параметрам зависит от характеристик установленного в конкретной печи магнетрона. Чем мощнее магнетрон, тем большую мощность должен развивать питающий его трансформатор. Таким образом, высоковольтный трансформатор и магнетрон образуют некую неразлучную пару. Основу трансформатора составляет сердечник, представляющий собой пакет набранный из Ш – образных пластин, изготовленных из электротехнической стали и скрепленных между собой посредством сварки (на рисунке сварные швы). К нижней части пакета приварен фланец, в виде прямоугольника из стального листа, посредством которого трансформатор крепится к днищу микроволновой печи. Трансформатор содержит три обмотки: первичную (сетевую), и две вторичных. К вторичным обмоткам относятся: обмотка накала и повышающая (анодная) обмотка. Сетевая обмотка намотана (как правило) эмалированным, алюминиевым проводом. Концы обмотки, выведены под клеммы. Накальная обмотка представляет собой 2 – 3 витка монтажного провода и предназначена для питания нити накала магнетрона. Выводы обмотки, в виде проводников оснащены разъемами, для удобства присоединения к клеммам магнетрона. Обмотка накала, выдает напряжение порядка 3,3В., при токе 10А. Точные значения тока и напряжения, зависят от конкретной пары, магнетрон – трансформатор. Повышающая обмотка формирует высокое напряжение необходимое для питания магнетрона. С этой обмотки снимается порядка 2000 вольт при токе 0,3А., точные значения так же зависят от конкретной пары магнетрон – трансформатор. Обмотка намотана эмалированным проводом. Один конец выведен под клемму, второй соединен с сердечником трансформатора (а через сердечник и с корпусом печи) посредством пайки. Вся конструкция трансформатора, для надежной изоляции обмоток и для устранения дребезга при работе, пропитана специальным пропиточным лаком.

К основным неисправностям высоковольтного трансформатора, можно отнести межвитковое замыкание в обмотках. Такая неисправность возникает в следствии нарушения изоляции между витками обмотки (разрушение эмали провода). Сопровождается усиленным гулом при работе трансформатора (даже без нагрузки) и значительным повышением температуры, как обмоток, так и сердечника. Визуально заметно потемнение эмали обмоточного провода и пропиточного материала. При длительной работе ощущается едкий запах.

Так как все обмотки трансформатора выполнены довольно толстым проводом, то обрыв обмоток возникает очень редко (если только в результате внешнего механического воздействия). Чаще, в результате не качественной пайки, возникает потеря контакта между одним из концов обмотки и клеммой (на рисунке место пайки). Клеммы трансформатора выполнены из медного сплава, который хорошо паяется, а вот обмотка намотана алюминиевым проводом, и спаять алюминий и медь, без специального флюса, практически не возможно. Наличие контакта можно проверить омметром. Накальная обмотка должна звониться практически накоротко, сетевая имеет сопротивление в районе 4ом, а повышающая приблизительно 150 – 200ом. Сопротивление обмоток зависит от параметров конкретного трансформатора.

Наиболее распространенной неисправностью цепей питания магнетрона – является пропадание контакта между клеммами обмоток трансформатора и разъемами внешних цепей печи. Происходит это в результате плохого обжима разъемов. Место плохого контакта начинает искрить, контактная поверхность разъема сильно греется и выгорает, в итоге контакт пропадает вовсе. Последствия плохого обжима разъемов изображены на рисунке.

Alexey () Уважаемые подскажите если кто сталкивался…Имеется голое железо от микроволновки LG.и есть желание перемотать на ток 7-10А, вторичка нужна 20вольт.И характеристики данного железа тоже интересны-подойдет ли для зар.устройства авто аккумуляторов? Feb 8, 2017 at 8:33 am

Eduard (Alvena)  Алексей, ну а чего ж не подойдет, подойдет конечно! Кинь размеры, я скажу сколько примерно с него мощности снять можно, и расчитаю.

Да, еще, сделай фотку с торца, хочу на набор пластин глянуть, а то по этой фото ниче не понятно.

Alexey (Rimona)  

Alexey (Rimona)  интересно для долговременного режима работы как он, а то мнения разделились….

Eduard (Alvena)  Блин, он что проварен сбоку? Это фигово. Возможно грется будет, но не смертельно, работать должен. Ну измерь размеры окна и сечения стержня.

Eduard (Alvena)  


Alexey (Rimona)  да проварен.я измерил.под фото файл безымянный.

Alexey (Rimona)  ну а насчет грется-склею и стяну железными хомутами

Alexey (Rimona)  Насколько мне известно, трансы от микроволновок всё-таки рассчитаны исключительно на кратковременный режим работы.

Eduard (Alvena)  Так вот, площадь окна маленькая, плохое охлаждение обмоток, да и витки туда очень тяжело все уместить.

И плюс сварка, ток холостого хода большой будет.А так. Первичка 490 витков провода 0, 55-0, 6мм. Примерно 100 метров провода. Вторичка 46 витков диаметром 1, 8мм, примерно 11-12 метров. Габаритная мощность 130вт, потери в обмотках 5вт, без учета холостого хода. Ну примерно 120вт. В итоге имеем 20в при токе до 6А.

Alexey (Rimona)  Алексей, да и у меня такая инфа есть.спасибо.

Alexey (Rimona)  Эдуард, спасибо за работу. сомнения мои оправдываются, лучше советского железа еще ничего не придумали, однако все реже и реже встречается.

Eduard (Alvena)  Алексей, это не так! Импортное железо лучше, так как позволяет работать на более высокой индукции, за счет этого получаем больше мощности при меньших габаритах! А кратковременный режим работы только потому, что с данного транса пытаются выжать больше чем он может дать. Я дал расчеты на долговременную работу, с запасом по мощности, току, индукции и напряжению. Он может часами работать при полной нагрузке.

Alexey (Rimona)  Эдуард, спасибо огромное за проделанную работу и за емкую, дельную информацию, осталось только витки уложить, особенно первичку ну а 6 А как раз для 55 аккумуляторов и то с запасом!!!

Eduard (Alvena)  Алексей, а там все вмещается, главное провод найти 0, 55-0, 6 не толще и не тоньше. Первичка примерно 7 слоев, займет с учетом каркаса и межслойной изоляции где то 7-8мм. Вторичка 2 слоя провода 1, 8-2мм, заимет соответственнго где то 4мм, и того 12-13мм в окне, а окно 15, так что все помещается.

Alexey (Rimona)  Эдуард, ну и отлично, жалко только намоточного станочка нету чтоб витки считал, придется на руках ну да не в первый раз!

Eduard (Alvena)  Алексей, а не надо все считать! Зачем? Считаем первый слой, к примеру 75 витков, а потом просто прибавляем слои! Ведь витки примерно одинаковые будут, ну там +/-2-3 витка, это пустяк. Это вот бублик мотать, да, там с каждым слоем витков все меньше, надо считать.

Ilya (Tobikuma)  намоточный станок делается из деревянного бруска, шпильки 30см, пары гаек, магнита, геркона, калькулятора…

Метки: Где можно перемотать трансформатор от микроволновой печи

В этом видео подробно показываю, как легко и быстро разобрать трансформатор от микроволновой печи, всего…

Где взять мощный трансформатор? Из чего можно вытащить? | Автор топика: Егор

Нужны трансформаторы от 400Вт и выше, вот только где так сокровища найти? Старые телевизоры, магнитофоны? Дядя извлек из старого советского телека броневой транс мощёностью 600-650Вт, довольно тяжелый. Не подскажите где такие же? Видел в деревне у соседа стоит в гараже Рубин нерабочий, чё там интересненько? Трансформаторы для дела.

Дмитрий  в старых совковых ламповых цветных телевизорах — 380 вт. .Руслан
можно ободрать всю вторичку и намотать свою. .

проще по барахолкам пройтись..

Павел  небыло таких телевизоров пи.. дит твой дядя!

Владислав  Старый цветной ламповый телевизор, трансформаторное зарядное устройство д\автомобиля, микроволновая печь, линейные трансформаторы проводного радиовещания.

Григорий  Если «Рубин» с импульсным блоком питания, ничего в нём не найдёшь для себя. Походи по рынкам, там часто старьё продают. Обязательно что-нибудь найдёшь.

Илья  В старых ЦВЕТНЫХ ламповых телевизорах стояли 250-270Вт, максимум 315 Вт.

Алексей  Микроволновки. Но учтите, что там трансформаторы работают с превышением габаритной мощности, в режиме насыщения сердечника.

Валерий  Со старых цветных ламповых телевизоров можно изготавливать любые трансформаторы от 250 Вт до 5 КВТ. Остается с железа ободрать все обмотки, сложить железо в нужные пакеты, конечно же понадобиться не один такой транс, сделать новый каркас и перемотать заново обмотки по расчету. Даже сварочный трансформатор можно соорудить с 4-х таких трансформаторов.

Игорь  Промышленные есть разных мощностей. На заводах надо интересоваться

трансформатор из микроволновки — Металлический форум

трансформатор из микроволновки: 01072011754.jpg трансформатор из микроволновки: …. перемотать можно, главное чтобы оно было нужно.

Применение трансформаторов от СВЧ печи [Архив] — Форумы АУДИО ПОРТАЛ

Разжился двумя трансформаторами от СВЧ-печи «Лена». Тип — АВЮ… Подскажите — можно ли их использовать в качестве выходных? (С перемоткой… советуйте…. А если использовать только железо, а катушки перемотать?

Сварочный аппарат хочет видеть практически каждый автолюбитель или просто человек, любящий проводить время за ремонтом либо созданием чего-либо. На рынке представлено большое разнообразие типов и моделей. «Что делать, если не хватает средств на приобретение сварочного аппарата?», — вопрос, всегда возникающий при мысли о покупке. Имея дома поломанную микроволновую печь, не спешите ее выбрасывать. Приложив немного усилий и времени из поломки можно сделать вполне работающий сварочный аппарат. Поговорим сегодня о том, как применяют трансформатор от микроволновки для сварки.

Важная деталь-трансформатор

В микроволновой печи есть только одна важная деталь, способная пригодиться в создании аппарата — трансформатор. Трансформатор в микроволновке представляет собой обычные две катушки из медного провода, намотанного на сердечник. Имеются две обмотки – первичная и вторичная. Катушки с обмоткой имеют разное количество витков проволоки: для того чтобы подключая к первичной обмотке напряжение, во второй катушке из-за индукции возникал ток с меньшим напряжением, а сила тока при этом возросла.


Извлечение

Для извлечения трансформатора из СВЧ печи необходимо аккуратно отсоединить крепеж на корпусе микроволновки, не повредив при этом обмотку трансформатора. При резком или сильно грубом извлечении может возникнуть разрыв в цепи, и тогда появятся лишние проблемы по перемотке катушки с обмоткой. Далее требуется произвести чистку катушек и сердечника от мелких стружек или мусора, попавшего во время разборки. Для проведения чистки можно использовать обычную щетку для покраски, главная чтобы она была сухая и чистая, как на фото.


Подготовка

Каждый сварщик знает, что если сварочный аппарат выдаёт малую силу тока, то это может сказаться на качестве сварного шва. Стоит заметить, что при увеличении ампеража в процессе сварки может возникнуть прожигание металла электродом. Попросту детали будут не свариваться между собой, а резаться. На вторичной обмотке трансформатора микроволновки возникает напряжение в 2 тыс. вольт, что довольно много. Для этого требуется перемотка вторичной обмотки проводом большего сечения. Для этого хорошо подойдёт повод типа ПВ-3 с сечением в 4 квадрата, он обладает хорошей гибкостью и не придется долго выгибать провод вокруг катушки. Производить перемотку требуется очень аккуратно, во избежание сделать повреждения на первичной обмотке. Для начала следует перекусить обмотку в нескольких местах и извлечь её из катушки. Затем, внимательно намотать каждый виток из нового провода. Число витков напрямую зависит от мощности трансформатора, так как микроволновки существуют с разными техническими характеристиками, соответственно трансформаторы монтируются согласно параметрам СВЧ печи. Когда перемотка завершена, следует нанести токоизоляционый лак на поверхность новой обмотки.


Монтирование

Берём во внимание, если мощность трансформатора 600–800 ватт, то будущий сварочный аппарат сможет производить сварку металла толщиной не более одного миллиметра. Если планируется сваривать более толстый металл, можно прибегнуть к соединению между собой двух трансформаторов, что значительно повысит мощность сварочного аппарата. Когда процесс перемотки закончен, и лак хорошо просох на новой обмотке, приступаем к соединению, учитывая, что у нас два трансформатора – первичные обмотки следует соединять параллельно, вторичные соответственно последовательно. Необходимо правильно соединить между собой выводы контактов обмоток, иначе возможно короткое замыкание.


Электроды для аппарата

Сварочный аппарат, как и споттер от микроволновой печи, осуществляет работу под средством электрода. Стержни для надёжной работы следует тщательно обработать, слегка подточив, в противном случае они легко утратят свою форму. Кабель, подходящий к электродам, должен иметь как можно меньшую длину и наименьшее количество соединений, чтобы не было потерь в мощности. На каждом из концов провода следует прикрепить медные наконечники. В процессе сварки возможно окисление меди, неспаянные участки будут давать лишнее сопротивление, что приведёт к потере мощности.


Монтирование корпуса

Будущий сварочный аппарат для безопасности следует поместить в прочный корпус, предварительно проделав по периметру ряд отверстий (чем больше, тем лучше) для осуществления должного охлаждения аппарата во время сварки. Для большего эффекта можно прикрепить с торцов корпуса два вентилятора. Для этого отлично подойдут кулеры охлаждения от системного блока персонального компьютера. Также очень часто такие трансформаторы применяют для создания катушки тесла и лампового усилителя.

Трансформаторы (страница 1)

Электромагнитные процессы в трансформаторе при холостом ходе

1. Установив, что задача связана с описанием электромагнитных процессов в трансформаторе при холостом ходе, дадим схемную интерпретацию данной задачи. Изобразим электромагнитную схему однофазного трансформатора и его условное графическое развернутое обозначение (рис. 1). Для произвольно выбранного направления силовых линий главного магнитного поля укажем направления ЭДС взаимной индукции в обмотках.

Числовые значения величин:
Определить:

Решение:
Подберем нужные формулы из теоретического раздела параграфа и подставим в них числовые значения заданных величин, предварительно выразив их в СИ.
Действующее значение ЭДС первичной обмотки


Магнитный поток в магнитопроводе выразим через магнитную индукцию и активное сечение стали магнитопровода:

С учетом (2)

Аналогично рассчитывается действующее значение ЭДС вторичной обмотки:

Амплитуды ЭДС в обмотках:

Мгновенные значения ЭДС при синусоидально изменяющемся магнитном потоке:

Пользуясь приложением 2, проверим размерность вычисляемых величин:

Ответ:

Электромагнитные процессы в трансформаторе при нагрузке

2. Задача относится к разделу «Электромагнитные процессы в трансформаторе при нагрузке» и, как следует из условия, требует графического решения с помощью векторной диаграммы.
Числовые значения величин:

Определить:

Решение:
Приступая к решению задачи, проведем небольшой предварительный анализ. Векторная диаграмма трансформатора является графической интерпретацией системы уравнений трансформатора. Запишем эту систему:

Сравнив систему (1)-(5) с исходными данными, легко заметить, что условие задачи позволяет непосредственно определить комплексные сопротивления первичной и вторичной обмотки: . Входящее в (4) полное сопротивление первичной обмотки при холостом ходе можно найти по исходным данным с учетом дополнительных соотношений:

Для решения системы необходимо величины вторичной обмотки привести к первичной, для чего надо знать значение коэффициента трансформации, которое в свою очередь можно определить по заданным величинам . Если к искомым по условию задачи величинам добавить неизвестную величину , то получим систему пяти уравнений с пятью неизвестными. Решим эту систему графически с помощью векторной диаграммы.
По (6) определим индуктивное сопротивление (или сопротивление взаимной индукции) и величину активного сопротивления .
Определим коэффициент трансформации

и приведенные вторичные величины:

Перейдем к определению искомых величин. Приведенный вторичный ток трансформатора

а его реальная величина (действующее значение)
Чтобы определить остальные величины, построим векторную диаграмму. Учитывая активно-индуктивный характер нагрузки, начало координат временной комплексной функции поместим в левом нижнем углу листа формата 200×170 мм, направляя действительную положительную ось по горизонтали (рис. 2).

Выбрав масштаб тока 1 см = 0,1 А, отложим на действительной оси обратный комплекс вторичного приведенного тока .
Выбрав масштаб напряжения 1 см = 30 В, отложим обратный комплекс приведенного вторичного напряжения .
Определим значения активной и реактивной составляющих падения напряжения на вторичной обмотке:

Из конечной точки вектора отложим в масштабе напряжения параллельно току вектор , по величине равный 12 В : 30 В/см = 0,4 см, и перпендикулярно — вектор , равный 30 В : 30 В/см = 1 см. Соединив конец этого вектора с началом координат, получим вектор ЭДС взаимной индукции , по величине равный .
Рассчитаем действующее значение тока холостого хода и фазового угла:

Под углом к направлению вектора отложим на диаграмме отрезок .
В соответствии с (5) векторная сумма токов определяет первичный ток трансформатора . Из построений видно, что .
Для определения первичного напряжения рассчитаем значения активной и реактивной составляющей падения напряжения на первичной обмотке и с конца вектора отложим векторы (рис. 6.2), по величине равные .
В результате получим вектор первичного напряжения , действующее значение которого .
Для удобства последовательность графических операций на рис. 6.2 показана цифрами 1-8.
Ответ:

Несимметричная нагрузка трехфазных трансформаторов

3. Задача относится к теме «Несимметричная нагрузка трехфазных трансформаторов» и связана с определением искажения симметрии первичных фазных и вторичных напряжений при заданной несимметричной нагрузке. Условие задачи полезно проиллюстрировать схематичным изображением трехфазного трансформатора, включенного по схеме и нагруженного несимметричными токами (рис. 3).

 

Числовые значения величин:

Определить:

Решение:

Анализируя условие задачи, отметим, что при соединении обмоток по схеме вторичные и соответственно первичные токи не содержат токов нулевой последовательности. В этом случае первичные и вторичные токи уравновешивают друг друга, поток и ЭДС нулевой последовательности равны нулю, а фазные первичные напряжения при симметричных линейных напряжениях получаются симметричными и определяются положением центра тяжести треугольника линейных напряжений. Вторичные фазные напряжения отличаются от первичных на величину падения напряжения на сопротивлении короткого замыкания.
Комплексные величины линейных первичных напряжений, заданные в показательной форме, запишем в комплексной алгебраической форме:


При отсутствии тока (потока и ЭДС) нулевой последовательности фазные первичные напряжения:


Видно, что трехфазная система первичных фазных напряжений симметрична.

Полученные соотношения можно проиллюстрировать графическими построениями векторной и топографической диаграмм (рис. 4). Размещая начало координат временной комплексной функции в центре листа, направляем действительную положительную ось по вертикали.

 

Выберем масштаб напряжения 1 см = 7 кВ и отложим векторы линейных напряжений . Прибавим к вектору вектор и возьмем третью часть полученного вектора, в результате имеем искомое фазное первичное напряжение . Аналогично строятся векторы . Соединив концы векторов, получим топографическую диаграмму — треугольник линейных напряжений. Легко убедиться, что фазные напряжения определяются «центром тяжести» треугольника.
Как уже отмечалось, вторичные напряжения трансформатора отличаются в данном случае от первичных на величину падения напряжения на сопротивлении короткого замыкания.

Определим составляющие полного сопротивления короткого замыкания, используя соотношения: . Найдем номинальный фазный первичный ток , полное сопротивление короткого замыкания

его активная и реактивная составляющие:

комплекс полного сопротивления короткого замыкания

Чтобы определить вторичные фазные токи при заданном соединении обмотки в треугольник, воспользуемся соотношениями:


Приведенные значения вторичных фазных токов:

Падения напряжения на сопротивлении короткого замыкания:

Приведенные вторичные фазные напряжения:

Вторичные фазные напряжения:

При заданной схеме соединений вторичной обмотки линейные напряжения равны фазным.

Для графической иллюстрации полученного решения построим векторную диаграмму первичных и вторичных напряжений трансформатора. Выбрав масштаб напряжения 1 см = 4 кВ и разместив начало координат временной комплексной функции в центре листа формата строим векторы первичных напряжений (рис. 5):

и обратные векторы приведенных вторичных напряжений:

Как видно из рис. 5, искажение симметрии вторичных фазных напряжений из-за симметрии токов сравнительно невелико, что обусловлено отсутствием токов нулевой последовательности.

Ответ:

Первичная и вторичная резистентность к ингибиторам тирозинкиназы при раке легких

Реферат

Предпосылки: Ингибиторы тирозинкиназы (TKI) стали важными терапевтическими агентами для лечения нескольких типов рака, включая рак легких. Недавние исследования показывают, что только небольшая группа больных раком реагирует на TKI, и, более того, у этих пациентов в конечном итоге развивается резистентность. Исследования подтверждают классификацию устойчивости на первичную и вторичную.Материалы и методы. В настоящем исследовании изучалась дифференциация между первичной и вторичной резистентностью к TKI в клеточных линиях рака легкого. Линии клеток рака легких были протестированы на жизнеспособность, апоптоз и клеточный цикл после воздействия TKI эрлотиниба и гефитиниба. Результаты. Клетки с первичной резистентностью показали сходные паттерны клеточного цикла с клетками со вторичной резистентностью, но между двумя группами наблюдались различия в анализах жизнеспособности и апоптоза. Заключение. Понимание влияния TKI на сигнальные пути клеток пролило бы свет на механизмы приобретенного сопротивления и различия между первичным и вторичным сопротивлением.

Сокращения: Er: Эрлотиниб; Ge: Гефитиниб; TKI: ингибиторы тирозинкиназы.

Ингибиторы тирозинкиназы — это новые терапевтические средства, которые применяются при лечении рака легких. Эти типы лекарств нацелены на определенные молекулы клетки, через которые блокируются сигнальные пути, тем самым предотвращая рост опухолевых клеток. Специально воздействуя на определенные молекулы клетки, незлокачественные клетки обычно не затрагиваются, что в конечном итоге приводит к снижению побочных эффектов у пациентов, проходящих лечение (1, 2).Из-за этого использование подходов таргетной терапии, таких как TKI, представляет собой предпочтительный способ лечения рака по сравнению с традиционной химиотерапией (3).

Несмотря на меньшее количество побочных эффектов, TKI все еще не оптимальны для лечения рака; эти препараты в основном применяются в качестве терапии 2-й или 3-й линии после неудачи химиотерапии (4-6). Некоторые из причин, по которым TKI неэффективны: высокая избирательная реактивность пациентов и развитие резистентности после воздействия препаратов (7).

Сообщалось, что некоторые пациенты очень хорошо реагируют на TKI, тогда как некоторые не реагируют вообще, когда они впервые получают лечение (8-10). Также было замечено, что у тех, кто реагирует на TKI, в конечном итоге после продолжительного воздействия развивается устойчивость к лекарствам (11, 12). Рассматривая эти две категории пациентов, можно сказать, что устойчивость к TKI является либо первичной, что означает, что пациенты вообще не реагируют на лечение, либо вторичной, что означает, что пациенты реагируют на лечение вначале, но развивают устойчивость позже.

Пациенты, которые хорошо реагируют, были идентифицированы как те, у кого есть мутации в гене рецептора эпидермального фактора роста ( EGFR ) (8, 13-16), тогда как те, кто не отвечает, являются носителями EGFR дикого типа и / или мутаций KRAS (12, 17, 18). TKI обычно нацеливается на тирозиновый домен EGFR, конкурируя за сайты связывания АТФ, что впоследствии предотвращает фосфорилирование EGFR. Это блокирует нижестоящий сигнальный путь EGFR, тем самым предотвращая рост раковых клеток.Некоторые из активирующих мутаций, связанных с этим механизмом, включают: L858R в экзоне 21, V765A и T783A в делециях экзона 20 в экзоне 19, таких как ΔLRE, (8, 19). Эти мутации называют активирующими мутациями, потому что они усиливают активность киназы, тем самым увеличивая сродство лекарств к EGFR.

Таким образом, вторичная устойчивость была связана с мутациями в гене EGFR . Сообщалось, что мутация T970M возникает у пациентов, проходящих терапию TKI, и связана с приобретенной резистентностью (10, 20, 21).Помимо мутаций в EGFR, амплификация MET также была идентифицирована как одна из причин приобретенной устойчивости к TKI (21, 22). С другой стороны, первичная устойчивость была связана с отсутствием активирующих мутаций в EGFR и активными генами множественной лекарственной устойчивости или активными переносчиками ABC.

В настоящем исследовании мы стремились сравнить первичную и вторичную резистентность к TKI, эрлотинибу и гефитинибу в клетках рака легкого. Эрлотиниб и гефитиниб являются наиболее часто используемыми ИТК при лечении рака легких и были одними из самых первых ИТК, одобренных для использования пациентами.Хотя было проведено несколько исследований для установления причин устойчивости к этим двум препаратам, информации, связывающей первичную устойчивость со вторичной резистентностью, не так много. Более того, большинство исследований сосредоточено на механизмах вторичной резистентности к TKI, а не на первичной резистентности.

Таким образом, целью настоящего исследования было сравнение клеток рака легких с первичной резистентностью с клетками со вторичной резистентностью после воздействия эрлотиниба и гефитиниба. Это было выполнено, чтобы установить сходство в способе действия препаратов на клетки с первичной и вторичной резистентностью.

Материалы и методы

Схема обучения. В этом исследовании использовались клеточных линий рака легкого A549 (DSMZ), h2299 (ATCC) и HCC827 (DSMZ). В модели клеточной культуры клетки HCC827 использовали для имитации вторичной резистентности. Это было выполнено путем культивирования клеток, подвергшихся воздействию тестируемых веществ в течение длительного периода времени (приблизительно 3 месяца). Вкратце, клетки высевали в колбы для культивирования клеток, а затем добавляли эрлотиниб и гефитиниб (LC Labs, Woburn, MA, USA) в концентрациях 1 мкМ и 10 мкМ.Среду для культивирования клеток меняли каждые 3 дня и в свежую среду добавляли лекарства. Ячейки были разделены только после слияния. Обработанные клетки сравнивали с контролями, и считалось, что резистентность возникла, когда обработанные клетки достигли слияния в то же время, что и контроль. Помимо исходной клеточной линии (которая называется родительской клеточной линией, переименованной в HCC827P), были получены две другие субклеточные линии, которые были переименованы в HCC827ErR (резистентный к эрлотинибу), HCC827GeR (устойчивый к гефитинибу).

Культура клеток. A549 культивировали в DMEM с 1% pen / strep и 10% FBS, h2299 — в RPMI с 1% pen / strep и 10% FBS, тогда как HCC827 культивировали в RPMI с 1% pen / strep и 15% FBS. Клетки промывали 1 раз PBS без Ca + Mg + и затем обрабатывали трипсином (A549 и h2299) или обрабатывали TrypLE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (HCC827) при 37 ° C в течение 3 минут. Затем реакцию останавливали, добавляя 10 мл среды для культивирования клеток, и затем клетки центрифугировали при 300 × g .Затем клетки ресуспендировали в 10 мл культуральной среды и подсчитывали в камере Нойбауэра после окрашивания 4% трипановым синим (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Клетки высевали в 96-луночные планшеты для анализов жизнеспособности и апоптоза при плотности 1 × 10 4 клеток на лунку. Для анализа клеточного цикла клетки высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 2,5 × 10 5 клеток на лунку. Через двадцать четыре часа среду меняли и к клеткам добавляли лекарства. Затем клетки дополнительно инкубировали с лекарствами при 37 ° C, 5% CO 2 перед проведением различных тестов.Используемые выше реагенты были получены от Biochrom (Biochrom, Берлин, Германия), если не указано иное.

Были проведены тесты на жизнеспособность, чтобы установить чувствительность клеток рака легких к эрлотинибу и гефитинибу. Клетки подвергали воздействию 0,01–100 мкМ эрлотиниба и гефитиниба, а затем проводили тест МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид) через 48 ч, 72 ч. и 96 ч. Реагент МТТ (Sigma Aldrich, Тауфкирхен, Германия) добавляли в каждую лунку в соотношении 1:10 и клетки инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч перед измерением оптической плотности на считывающем устройстве для планшетов Tecan при 650 нм.После установления чувствительности клеток к лекарственным средствам были проведены анализы апоптоза, чтобы выяснить, действительно ли лекарственные средства вызывают апоптоз. Анализ каспазы ApoOne 3/7 (Promega, Mannheim, Germany) проводили через 48 ч после воздействия на клетки лекарственных средств. Реагент ApoOne добавляли в каждую лунку в соотношении 1: 1 с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем люминесценцию измеряли на считывающем устройстве для планшетов Tecan. Наконец, был проведен анализ клеточного цикла, чтобы установить, вызывают ли лекарства остановку клеточного цикла в клетках рака легких.Клетки фиксировали в ледяном этаноле, после трипсинизации клетки промывали 1 × PBS и затем ресуспендировали в 500 мкл PBS с последующим добавлением 1,5 мл ледяного этанола. Для окрашивания клеток их центрифугировали, а затем аспирировали этанолом перед добавлением 500 мкл буфера йодида пропидия (BD, Heidelberg, Германия). FACS-анализ проводился на оборудовании Beckman Coulter® FC500. Клетки подвергались воздействию тестируемых веществ за 48 ч до анализа FACS.

Статистический анализ. Статистический анализ был проведен для каждого эксперимента, были включены три независимых испытания. Собранные данные были обобщены в таблицах Excel и проведен базовый статистический анализ. Дальнейший статистический анализ и построение графиков были выполнены с помощью SigmaPlot 11.0. Был проведен дисперсионный анализ (тест Холма Сидака) для сравнения трех групп клеток с целью определения их чувствительности к эрлотинибу и гефитинибу. Уровни значимости были установлены между отдельными клеточными линиями по отношению к их необработанному контролю, а также между различными клеточными линиями.

Результаты

Чувствительность клеток A549, h2299 и HCC827 к эрлотинибу и гефитинибу. Клетки рака легких A549, h2299 и HCC827 были протестированы на чувствительность к эрлотинибу и гефитинибу. На рисунке 1 показано влияние препаратов на рост клеток в разные периоды инкубации. Эрлотиниб и гефитиниб показали зависимое от концентрации ингибирование роста клеток A549 (рост клеток снижался с увеличением концентрации лекарственного средства). Кроме того, рост клеток снизился примерно на 20% между самым низким (0.01 мкМ) и наивысшие (100 мкМ) концентрации для обоих препаратов, за исключением клеток, обработанных гефитинибом, через 96 ч, где наблюдалось снижение на 40%. Через 96 часов гефитиниб показал наибольшее ингибирование роста, тогда как эрлотиниб оказал наибольшее влияние на рост через 72 часа. Эрлотиниб показал постепенное снижение роста клеток с увеличением концентрации лекарственного средства через 48 и 72 часа, но не через 96 часов, при этом рост снижался только при более низких концентрациях (<1 мкМ), а затем количество клеток снова увеличивалось при концентрации 1 мкМ.Гефитиниб, с другой стороны, показал постепенное уменьшение количества клеток через 72 часа. Через 48 ч рост клеток оставался постоянным между 1 мкМ и 100 мкМ. Через 96 часов наблюдалось резкое снижение количества клеток между 10 мкМ и 100 мкМ.

Фигура 1.

Кривые зависимости реакции от концентрации клеток рака легких после воздействия эрлотиниба и гефитиниба. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью теста МТТ, и измерения проводили через 48, 72 и 96 часов после обработки различными концентрациями эрлотиниба и гефитиниба.

Зависимое от концентрации ингибирование роста эрлотиниба также наблюдалось в клетках h2299, и, кроме того, более высокие концентрации приводили к усиленному ингибированию роста. Клетки, обработанные эрлотинибом, также показали постепенное снижение роста клеток при более низких концентрациях и быстрое снижение между 1 мкМ и 100 мкМ. Разница в росте клеток между 0,01 мкМ и 100 мкМ составляла 40%. С другой стороны, клетки, обработанные гефитинибом, показали снижение роста клеток при 0,01 мкМ через 72 и 96 часов инкубационного периода, но не через 48 часов, и это оставалось почти постоянным для всех применяемых концентраций.Разница в росте около 10% наблюдалась между самой низкой и самой высокой концентрациями через 96 часов, но не через 48 и 72 часа. Различное время инкубации показало сходные тенденции роста клеток. Однако самый низкий рост клеток наблюдался через 96 ч в клетках, обработанных эрлотинибом, а также в клетках, обработанных гефитинибом. Рост клеток резко упал в клетках, обработанных эрлотинибом, при 10 мкМ и 100 мкМ после 48 ч, 72 ч и 96 ч инкубации. С другой стороны, рост клеток, обработанных гефитинибом, был постепенным.Было замечено, что эрлотиниб оказывает более сильное цитотоксическое действие на клетки, чем гефитиниб.

Эрлотиниб и гефитиниб подавляли рост клеток HCC827, однако увеличение дозы не показало усиленного подавления роста. Рост клеток значительно снизился при 0,01 мкМ (примерно на 40%), а затем оставался постоянным при увеличении концентрации; это наблюдалось как в клетках, обработанных эрлотинибом, так и в клетках, обработанных гефитинибом. Различий в росте клеток между самой низкой концентрацией лекарства и самой высокой концентрацией лекарства не наблюдалось.Клетки были более чувствительны к эрлотинибу, чем к гефитинибу, однако различия не были значительными ( p > 0,05). Аналогичные тенденции роста клеток наблюдались во все периоды инкубации. Дальнейшая инкубация не увеличивала скорость торможения роста; наивысшее ингибирование было зарегистрировано через 48 часов, а не через 96 часов, как описано в A549 и h2299.

Был проведен статистический анализ измерений конечных точек, результаты представлены на рисунке 2. Для клеток, обработанных эрлотинибом, значимые различия наблюдались в клетках A549 и HCC827 при всех концентрациях ( p <0.05). Однако в клетках HCC827 различия были больше в HCC827, чем в A549. Это вообще наблюдалось концентрации ( p <0,001). С другой стороны, клетки h2299 показали значимые различия только при 10 мкМ ( p = 0,004) и 100 мкМ ( p = 0,001). Однако эти клетки (h2299) показали наивысшее ингибирование роста при 100 мкМ. Эффекты эрлотиниба на клетки A549 и HCC827 были сопоставимы через 96 часов, однако кривые зависимости реакции от концентрации на рисунке 1 показали большие различия между двумя линиями клеток в разных точках инкубации.

Рисунок 2.

Ингибирование роста эрлотиниба и гефитиниба клеток A549, h2299 и HCC827 через 96 часов. Результаты выражаются в процентах от контролей.

Клетки, обработанные гефитинибом, показали значительные различия между обработанными образцами и контролем в клетках A549 и HCC827 при всех концентрациях ( p <0,05), кроме 0,01 мкМ в клетках A459 ( p = 0,056). Кроме того, значимые различия наблюдались только при 100 мкМ ( p = 0,003) в клетках h2299, тогда как остальные концентрации не показали значительных отличий от контроля ( p > 0.05). Клетки A549 показали наивысшее ингибирование роста при обработке 100 мкМ гефитиниба. Как правило, аналогичные наблюдения были сделаны для клеток, обработанных гефитинибом, а также для клеток, обработанных эрлотинибом, в результате чего ингибирование роста гефитинибом в клетках A549 и HCC827 было сравнимо при всех концентрациях, кроме 100 мкМ, где клетки A549 показали наименьший рост клеток.

Чувствительность клеток HCC827 к эрлотинибу и гефитинибу после развития резистентности. Из результатов, представленных на Фигуре 1, было видно, что клетки HCC827 были более чувствительны к тестируемым веществам, чем клетки A549 и h2299.Из-за их чувствительности клетки HCC827 были использованы для моделирования вторичной резистентности путем воздействия на них лекарств. Таким образом можно было выделить устойчивые клетки из чувствительных. Позже резистентные клетки были проверены на жизнеспособность после воздействия исследуемых препаратов, как описано в предыдущем разделе. На Фигуре 3 показано влияние эрлотиниба и гефитиниба на рост линий субклеток устойчивости.

Во всех клетках наблюдалось дозозависимое ингибирование роста эрлотиниба.Однако наблюдались различия между родительскими и устойчивыми клетками. В HCC827P рост клеток резко снизился при 0,01 мкМ, но увеличение концентрации показало постепенное снижение роста клеток. Это наблюдалось через 48 и 72 часа, но не через 96 часов, при этом уменьшение роста клеток было постепенным при всех концентрациях, уменьшаясь с увеличением концентрации лекарственного средства. Было обнаружено, что рост устойчивых клеток HCC827ErR и HCC827GeR увеличивался при 0,01 мкМ, а затем постепенно снижался с увеличением концентрации лекарственного средства.

Ингибирование роста эрлотиниба на устойчивых клетках отличалось от такового для родительской клеточной линии; в устойчивых клетках наблюдали пониженное ингибирование лекарственного средства, при этом регистрировали двукратное различие между родительскими и устойчивыми клетками. Продолжительные периоды инкубации не выявили различий в росте клеток для всех клеток, поскольку одинаковые тенденции наблюдались через 48, 72 и 96 часов. Наименьшее влияние на эрлотиниб-устойчивые клетки оказал Эрлотиниб. Однако эффекты Эрлотиниб по ингибированию роста в устойчивых к гефитинибу клетках был аналогичен таковому у устойчивых к эрлотинибу клеток.

Рисунок 3.

Кривые доза-ответ клеток HCC827 после развития устойчивости. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа МТТ, и измерения проводили через 48, 72 и 96 часов после обработки лекарством. Устойчивые клетки обрабатывали вместе с родительскими клетками для сравнения устойчивости к чувствительным клеткам.

Гефитиниб также показал дозозависимое ингибирование во всех клетках с различиями между родительскими и устойчивыми клетками. Как наблюдалось в клетках, обработанных эрлотинибом, резкое снижение роста клеток также наблюдалось в клетках HCC827P, обработанных гефитинибом.Это было зарегистрировано при 0,01 мкМ, и увеличение концентрации лекарственного средства приводило к постепенному снижению роста клеток. Эта тенденция наблюдалась через 48, 72 и 96 часов. Рост клеток в HCC827ErR и HCC928Ger постепенно снижался с увеличением концентрации лекарственного средства. Однако через 96 часов ситуация была иной, когда рост клеток увеличивался при 0,01 мкМ, но затем снижался при увеличении концентраций между 0,10 мкМ и 100 мкМ.

Подавление роста лекарственных средств на резистентных клетках снижено вдвое по сравнению с родительскими клетками.Между инкубационными периодами наблюдались незначительные различия. Через 48 и 96 часов ингибирование роста было немного выше, чем через 72 часа в HCC827P, а самый низкий рост наблюдался при 100 мкМ через 96 часов. Гефитиниб показал наименьшее влияние на рост устойчивых к эрлотинибу клеток, однако различия между двумя устойчивыми клеточными линиями не были значительными. Сходные тенденции наблюдались в клетках HCC827ErR и HCC827GeR, обработанных либо эрлотинибом, либо гефитинибом, независимо от того, к лекарству клетки были устойчивы, а клетки HCC827ErR показали наименьшую чувствительность к лекарствам.

Был проведен статистический анализ конечных результатов измерений, результаты представлены на Рисунке 4.

Анализы проводили через 96 часов, потому что это точка, в которой было достигнуто максимальное ингибирование роста для всех клеток. С одной стороны, образцы в различных концентрациях сравнивали с образцами необработанного контроля, чтобы установить эффекты лекарств на отдельные клеточные линии. С другой стороны, образцы сравнивали с родительскими клетками для каждого уровня концентрации лекарственного средства, чтобы определить различия в действии лекарств между родительскими клетками и устойчивыми клетками.

Рисунок 4.

Графики ингибирования роста эрлотиниба и гефитиниба через 96 ч для клеток HCC827P, HCC827ErR и HCC827GeR. Тесты на жизнеспособность проводились после воздействия на клетки эрлотиниба и гефитиниба в течение трех месяцев.

При сравнении клеток, обработанных эрлотинибом, с необработанным контролем, значительные различия наблюдались в клетках HCC827P при всех концентрациях ( p <0,05), но не в клетках HCC827ErR и HCC827GeR ( p > 0,05), за исключением клеток HCC827ErR. 0.01 мкМ ( p = 0,007) и 0,1 мкМ ( p = 0,004).

обработанных гефитинибом клеток также сравнивали с необработанным контролем, в этом случае клетки HCC827P показали значительные различия при всех концентрациях за исключением 0,01 мкМ ( p = 0,130). Не наблюдалось значительных различий в клетках HCC827ErR и HCC827GeR при всех концентрациях ( p > 0,05). Другое сравнение было выполнено между родительскими клетками и устойчивыми клетками. В этом случае наблюдались значительные различия между клетками HCC827P и HCC827ER, а также между клетками HCC828P и HCC827GeR при всех концентрациях ( p <0.05).

Активность каспазы 3/7 клеток рака легкого с первичной и вторичной резистентностью по сравнению с чувствительными клетками. Чтобы выяснить, вызывают ли эрлотиниб и гефитиниб апоптоз в клетках рака легких, был проведен анализ апоптоза, результаты которого представлены на фиг. 5. По сравнению с контролем активность каспазы 3/7 значительно увеличилась в клетках HCC827 ( p <0,001), тогда как в клетках A549 ( p = 0,705) и h2299 ( p = 0,582) не наблюдалось никакого влияния на активность каспазы.Увеличение концентрации препарата привело к увеличению активности каспаз; однако это было значимо только для клеток HCC827, но не для клеток A549 и h2299. В клетках HCC827 гефитиниб показал повышение активности каспаз по сравнению с эрлотинибом в клетках A549 и h2299, однако различий между двумя препаратами не было. Активность каспазы обработанных образцов была намного выше в клетках HCC827, чем в клеточных линиях A549 и h2299, разница в активности каспазы между HCC827 и другими линиями клеток была примерно в три раза.

Активность каспазы 3/7 значительно увеличилась в клетках HCC827P по сравнению с необработанными контролями ( p <0,05) в клетках, обработанных эрлотинибом, а также клетках, обработанных гефитинибом. Значительные различия наблюдались также между клетками HCC827ErR, клетками HCC827GeR и их соответствующими необработанными контролями ( p <0,05). Устойчивые клетки (HCC827ErR и HCC827GeR) сравнивали с родительскими клетками (HCC827P), и результаты показали, что активность каспазы снизилась в устойчивых клетках, но различия не были значительными ( p > 0.05). Повышение концентрации препарата не повлияло на активность каспазы 3/7 как для эрлотиниба, так и для гефитиниба во всех образцах. Каждое лекарство оказывало действие на обе резистентные клетки, поскольку влияние на активность каспазы для обоих лекарств было значительно снижено как в клетках, устойчивых к эрлотинибу, так и к гефитинибу, , т.е. эрлотиниб оказывал одинаковое действие на клетки, устойчивые к эрлотинибу и гефитинибу, и наоборот. .

Рисунок 5.

Активность каспазы клеток рака легкого тестировали после воздействия на клетки эрлотиниба и гефитиниба (1 и 10 мкМ).A: Активность каспазы 3/7 отдельных клеточных линий сравнивали с необработанным контролем. B: Активность каспазы 3/7 устойчивых клеток HCC827 сравнивали с необработанным контролем, а также с родительскими клетками (p <0,05). Er означает эрлотиниб, а Ge - гефитиниб.

Анализ клеточного цикла клеток рака легких с первичной и вторичной резистентностью по сравнению с чувствительными клетками. Анализ клеточного цикла проводили на всех клеточных линиях. Клетки были сгруппированы в 3 фазы: апоптотическая фаза, G 0 / G 1 и G 2 / M.Анализ проводили после воздействия на клетки эрлотиниба и гефитиниба, чтобы определить влияние препаратов на клеточный цикл. Графики на рисунке 6 показывают распределение клеток в различных фазах клеточного цикла.

Ячейки A549. Количество апоптотических клеток немного увеличилось после воздействия лекарственного средства в обработанных образцах по сравнению с контролем. Повышенные концентрации эрлотиниба приводили к увеличению количества апоптозных клеток. Однако количество апоптотических клеток уменьшалось с увеличением концентрации гефитиниба.Большинство клеток (> 50%) появилось в фазе G 1 , хотя наблюдался сдвиг в сторону апоптотической фазы в обработанных образцах по сравнению с контролями. Число клеток в фазе G 2 / M оставалось постоянным в клетках, обработанных эрлотинибом, а также в клетках, обработанных гефитинибом, однако между двумя препаратами наблюдались различия: количество клеток, обработанных гефитинибом, было меньше в G 2 / M фазы, чем фазы, обработанные эрлотинибом, а также контроли. Статистически количество апоптотических клеток значительно увеличивалось при сравнении обработанных образцов с контролем ( p <0.05). Более того, не наблюдали значительных различий в фазе G 0 / G 1 , кроме клеток, обработанных гефитинибом при концентрации 1 мкМ ( p = 0,002). Фаза G 2 / M не показала каких-либо существенных различий в количестве клеток по сравнению с контролем.

х2299 ячеек. Распределение обработанных клеток сравнивали с распределением контрольных клеток культуры h2299, наблюдался сдвиг в сторону апоптотических клеток. Эти клетки увеличились после воздействия эрлотиниба и гефитиниба.Как и в случае с ячейками A549, большинство ячеек (> 50%) появилось в фазе G 0 / G 1 . Количество клеток в фазе G 2 / M оставалось постоянным во всех образцах, а количество было таким же, как и в контроле. Увеличение количества апоптотических клеток было значительным только в образцах, обработанных эрлотинибом при концентрации 10 мкМ ( p <0,001) по сравнению с контролями. Фазы G 0 / G 1 и G 2 / M не показали значительных различий в количестве клеток между обработанными образцами и контролями ( p > 0.05).

клеток HCC827. Распределение клеток HCC827 выявило сдвиг во всех фазах: , т.е. апоптотических клеток, а также клетки в фазе G 0 / G 1 увеличились в обработанных образцах, но количество клеток в G 2 / М-фаза уменьшилась. Большинство (> 50%) клеток появилось в фазе G 0 / G 1 в обработанных образцах, но не в контроле, где G 0 / G 1 и G 2 / M показал равное количество ячеек.Апоптотические клетки значительно увеличились во всех обработанных образцах по сравнению с контроли ( p <0,001). Увеличение концентрации лекарственного средства привело к увеличению апоптоза в образцах, обработанных эрлотинибом, а также в образцах, обработанных гефитинибом. Значительные различия наблюдались также в количестве клеток в фазе G 0 / G 1 и G 2 / M по сравнению с контролем ( p <0,001). В отличие от A549 и h2299, у HCC827 было больше клеток в фазе G 0 / G 1 , и эти клетки значительно увеличились в образцах, обработанных гефитинибом при концентрации 10 мкМ.

Рисунок 6.

Анализ клеточного цикла клеток рака легких выполняли через 48 часов после воздействия на клетки эрлотиниба и гефитиниба в концентрации 1 и 10 мкМ. Клетки окрашивали PI перед анализом с помощью FACS. Были исследованы изменения в паттернах клеточного цикла в фазах G 0 / G 1 , G 2 / M, а также в апоптотической популяции (p <0,05). Er, Эрлотиниб; Ge, гефитиниб.

Наблюдался сдвиг в клетках HCC827ErR в сторону апоптотической популяции при 10 мкМ и в сторону фазы G 0 / G 1 при 1 мкМ; большинство ячеек (> 50%) появилось в фазе G 0 / G 1 .Количество ячеек в фазе G 2 / M было одинаковым во всех образцах. Статистический анализ показал, что количество апоптотических клеток значительно увеличилось ( p <0,05) в клетках, обработанных эрлотинибом, а также в клетках, обработанных гефитинибом, при 10 мкМ. При более низкой концентрации (1 мкМ) лекарств количество апоптотических клеток уменьшалось по сравнению с контролем, но это не было значительным. Не было значительных различий в количестве клеток в фазах G 0 / G 1 и G 2 / M, когда обработанные образцы сравнивали с контролем.

В клетках HCC827GeR наблюдался сдвиг в сторону G 2 / M в обработанных эрлотинибом клетках при 10 мкМ и в сторону G 0 / G 1 в обработанных гефитинибом клетках при 1 мкМ, а также при 10 мкМ. . Такое же количество ячеек было в фазах G 0 / G 1 и G 2 / M. Апоптотические клетки значительно уменьшились ( p <0,001) в клетках, обработанных гефитинибом, но не в клетках, обработанных эрлотинибом, по сравнению с контролем. Достоверных различий не было ( p > 0.05), наблюдаемые в фазе G 0 / G 1 и G 2 / M во всех образцах, кроме обработанных эрлотинибом клеток при 10 мкМ ( p <0,001).

Обсуждение

В настоящем исследовании сравнивали первичную и вторичную резистентность к TKI при раке легкого. Наблюдались сходства и различия между клетками с первичной и вторичной резистентностью. Из тестов жизнеспособности было очевидно, что клетки показали различия в чувствительности к лекарствам, A549 был промежуточным, устойчивым к h2299 и чувствительным к HCC827.Сообщалось, что чувствительность к TKI коррелирует с мутациями в EGFR (8, 15, 22). Тестируемые клетки имели либо мутацию в EGFR (HCC827), либо в EGFR дикого типа (A549 и h2299). По полученным результатам это исследование согласуется с другими исследованиями, в которых сообщается о чувствительности в клетках с мутациями и устойчивости в клетках с EGFR дикого типа. В этом случае h2299 и A549 представляли собой первично резистентные клетки.

Развитие вторичной устойчивости наблюдалось в клетках HCC827 после воздействия на них эрлотиниба и гефитиниба в течение трех месяцев.Результаты по жизнеспособности показывают, что линии устойчивых субклеток обладают пониженным ингибированием роста тестируемых веществ по сравнению с родительскими клетками. Сообщается, что развитие резистентности у пациентов, проходящих лечение, происходит в течение 10 месяцев (10, 11). Maemondo и др. . и Маргулеску и др. . сообщили о выживаемости без прогрессирования заболевания у пациентов, получавших гефитиниб, в среднем 10 месяцев (23, 24). Однако в модели клеточной культуры устойчивость наблюдалась уже через 3 месяца после первоначального воздействия на клетки лекарств.

Сравнение результатов жизнеспособности клеток с первичной устойчивостью и клеток со вторичной устойчивостью; наблюдали, что ингибирование роста клеток тестируемыми веществами было очень низким в обеих группах. Рост чувствительных клеток снижается после того, как клетки развивают резистентность. Это указывает на то, что эрлотиниб и гефитиниб не могут подавлять рост как первичных, так и вторичных резистентных клеток, хотя и с разной скоростью.

Помимо ингибирования роста клеток, TKI вызывает апоптоз в раковых клетках, и это наблюдалось после обработки TKI-чувствительных клеток эролитинибом и гефитинибом.Сообщалось об индукции апоптоза в TKI-чувствительных клетках (25). Эрлотиниб и гефитиниб индуцировали апоптоз в чувствительных клетках, но не в клетках с первичной резистентностью. Чувствительная линия HCC827 показала трехкратное увеличение, тогда как A549 и h2299 не показали никаких различий в активности каспаз. С другой стороны, устойчивые линии субклеток показали повышение активности каспаз, однако оно было ниже, чем у родительских клеток. В отличие от клеток A549 и h2299 устойчивые субклеточные линии показали повышение активности каспаз.Можно сделать вывод, что, несмотря на развитие резистентности клеток HCC827, препараты все же могут вызывать апоптоз, хотя и с меньшей скоростью, чем в родительских клетках. Результаты анализов апоптоза показали, что, когда клетки развивают резистентность, способность лекарств вызывать апоптоз снижается. Однако это несопоставимо с клетками со вторичной резистентностью, в которых лекарства вообще не индуцируют апоптоз.

Сообщалось, что

TKI вызывает остановку клеточного цикла G 0 / G 1 (26–29).В настоящем исследовании это наблюдалось только в чувствительных клетках, где анализ клеточного цикла показал, что количество клеток в G 0 / G 1 увеличилось в чувствительных клетках, а не в устойчивых клетках, по сравнению с контролем. каждой отдельной клеточной линии. Таким образом, тестируемые вещества вызывали остановку клеточного цикла только в чувствительных, а не в устойчивых клетках.

В целом, сдвиг вправо наблюдался в HCC827, где апоптотические клетки и клетки в фазе G 0 / G 1 увеличились, тогда как в фазе G 2 / M уменьшились.Для устойчивых клеток количество клеток во всех фазах не показало значительных отличий от контроля, за исключением нескольких случаев, которыми являются: клетки A549, обработанные гефитинибом, и устойчивые к эрлотинибу клетки, обработанные эрлотинибом.

A G 0 / G 1 Остановка клеточного цикла в чувствительных клетках свидетельствует об ингибировании EGFR эрлотинибом и гефитинибом. Чтобы перейти от фазы G 0 / G 1 к фазе G 2 / M, клеткам необходимо достаточное количество факторов роста (30-32).Поскольку EFGR был заблокирован, клетки не получали факторов роста и не переходили к следующей фазе. Противоположное наблюдалось как для первичных, так и для вторично устойчивых клеток, поскольку клетки были способны перейти в фазу G 2 / M, что означает, что EGFR не ингибировался и клетки имели достаточный запас факторов роста.

Было очевидно, что существует сходство между клетками с первичной и вторичной резистентностью. Это наблюдали с помощью анализов жизнеспособности, а также анализа клеточного цикла.Анализы апоптоза показали различия между первичной резистентностью и вторичной резистентностью. Было бы интересно дополнительно изучить влияние TKI на сигнальные пути клеток, чтобы выяснить механизмы приобретенной устойчивости и установить различия между первичной и вторичной резистентностью.

Благодарности

Мы благодарим Николь Пич и Марен Нойман за их техническую поддержку. Работа поддержана Deutsche Lungenstiftung e.V. и Deutsche Atemwegsliga e.V.

  • Получено 8 января 2014 г.
  • Исправление получено 6 апреля 2014 г.
  • Принято 7 апреля 2014 г.
  • Авторские права © 2014 Международный институт противораковых исследований (доктор Джон Г. Делинассиос), Все права защищены

Модуль седьмой (B), мероприятие 4 — Изучение Африки

Африканское сопротивление, национализм и независимость

Африканские народы по-разному реагировали на колониальное правление.Сторонники колониализма в Европе утверждали, что средний африканец приветствует колониализм. Они утверждали, что колониализм положил конец рабству в Восточной и Центральной Африке и положил конец войне между королевствами в некоторых частях Западной Африки. Хотя есть доля правды в утверждении, что колониализм принес мир в некоторые районы Африки и что были некоторые народы, которые изначально были благодарны за прекращение насилия в своих районах, исторические свидетельства не подтверждают утверждение о том, что это было широко распространено. поддержка колониального правления.В самом деле, есть также веские доказательства сильного сопротивления колониальному правлению.

К началу Первой мировой войны в 1914 году вся Африка, за исключением Либерии и Эфиопии, была колонизирована, и первоначальное африканское сопротивление было преодолено колониальными державами. В следующие десятилетия, когда колониальное правление стало институционализированным, африканское сопротивление колониализму стало более целенаправленным и интенсивным. К 1950-м годам существовали организованные националистические партии, которые требовали политической независимости почти в каждой колонии в Африке.

В этом последнем разделе этого модуля мы рассмотрим четыре фазы африканской реакции на колониальное правление: раннее сопротивление, требование равенства и интеграции, национализм / массовое движение и борьба за национальное освобождение.

Раннее (первичное) сопротивление колониализму

Ранняя реакция африканцев на европейское вторжение в Африку в конце 19 века не была единообразной. Несколько групп, пострадавших от длительных войн или набегов рабов (например, в некоторых частях Восточной Африки), неуверенно приветствовали европейское присутствие в своих регионах в надежде, что наступит мир.Другие группы сильно сопротивлялись приходу европейского политического контроля. Однако многие люди не отреагировали на колониализм. Это произошло потому, что первые годы колониализма мало повлияли на жизнь многих сельских африканских народов. Эта ситуация изменилась по мере того, как влияние колониализма стало более распространенным и интенсивным в середине 20-го века.

На протяжении всего периода битвы за Африку , , европейские колонизаторы столкнулись с ожесточенным сопротивлением во многих частях Африки.Чтобы представить информацию обо всех случаях сопротивления, потребуется слишком много времени и места. На карте ниже указаны семь примеров сопротивления колониальному правлению со всей Африки на раннем этапе. Цифры в списке ниже соответствуют номерам на карте. Щелкнув по номеру в списке, вы получите информацию об этом конкретном выражении сопротивления.

Примеры сопротивления:

  1. Сопротивление Чимуренга (Зимбабве)
  2. Битва при Исандлаване
  3. Восстание Маджи-Маджи (Танганьика)
  4. Битва при Адове (Эфиопия)
  5. Сопротивление асанте (Гана)
  6. Самори Туре
  7. Ливийское сопротивление

Требования к акционерному капиталу и интеграции: межвоенные годы

К концу Первой мировой войны большая часть Африки была фактически колонизирована.Европейским колонизаторам удалось подавить попытки африканцев противостоять установлению колониального господства. Следующие два десятилетия, которые историки называют межвоенными годами, были относительно спокойными годами в колониальной Африке. Эта относительная тишина, однако, не означала, что колониальные народы Африки были довольны колониальным правлением или что колониализм не сопротивлялся.

В межвоенные годы противостояние колониализму выражалось в одной из следующих форм:

  • Требования к возможностям и включению : Многие африканцы в то время принимали реальность колониального правления, но они не принимали жесткую дискриминацию и отсутствие возможностей, которые были центральной частью колониального опыта.Противодействие этим аспектам колониализма было особенно сильным среди образованных африканцев. Образованные африканцы считали, что «все люди созданы равными». Дискриминационная колониальная политика и практика ограничивали экономические возможности и участие в политическом процессе. В течение этого периода образованные африканцы создавали организации, чтобы продвигать свои интересы, чтобы положить конец дискриминационной политике и расширить возможности. Однако в этих организациях было ограниченное количество членов, и они не выдвигали радикальных требований о прекращении колониального правления.Южноафриканский национальный конгресс и Западноафриканский национальный конгресс (Нигерия / Гана) являются примерами элитных африканских организаций.
  • Религиозная оппозиция : Ряд первых антиколониальных восстаний, о которых говорилось в последнем разделе, возглавляли религиозные лидеры. Восстания Чимуренга (Зимбабве) и Маджи-Маджи (Танганьика) возглавили африканские священники, решительно выступавшие против колониального правления. Эта традиция религиозного противостояния колониализму продолжалась на протяжении всего 20 века.Однако, в отличие от более ранних актов религиозного сопротивления, новую оппозицию возглавили африканские христиане. Африканские христиане серьезно относились к христианским учениям о ценностях равенства и справедливости, которые не практиковались колониальными режимами. К 1920-м годам некоторые африканские христианские лидеры сформировали свои собственные церкви, иногда называемые африканскими независимыми церквями. Эти церкви, которые были созданы в Южной, Восточной, Центральной и Западной Африке, выступили сильным голосом за справедливость. Одним из многих примеров является христианская церковь кимбагистов, основанная в Конго Саймоном Кимбангу в 1920-х годах.Несмотря на многолетнее заключение Кимбангу бельгийцами, кимбангуистская церковь быстро росла. Когда в 1960 году Конго обрело независимость, в церкви насчитывалось более миллиона членов.
  • Экономическая оппозиция : В этот период экономическая оппозиция часто не была хорошо организована. Однако в 1920-х и 1930-х годах горняки на юге Африки и портовые рабочие в Западной и Восточной Африке предпринимали попытки объединиться в профсоюзы. Несмотря на свою важность, эти мероприятия мало повлияли на большинство африканских народов.Большее влияние имели менее организованные, но более широкие усилия африканских фермеров противостоять колониальным требованиям в отношении их труда и своей земли. Модуль девятый: Экономика Африки представляет собой пример того, как мелкие африканские фермеры в Мали тихо, но эффективно сопротивлялись попыткам колониальных властей контролировать производство хлопка.
  • Массовые протесты : В межвоенный период массовых протестов против колониальной политики было немного. Одним из наиболее важных и интересных исключений была война женщин в Абе , которая произошла на юго-востоке Нигерии в 1929 году.Женщины с рынка Ибо были недовольны рядом колониальных политик, которые угрожали их экономическому и социальному положению. В 1929 году женщины устроили серию акций протеста. Самый крупный протест охватил более 10 000 женщин, которые покрыли лицо синей краской и несли палки, покрытые папоротником. Женщинам удалось разрушить ряд колониальных зданий, прежде чем солдаты остановили протест, в результате чего погибло более пятидесяти женщин. Неудивительно, что в современной Нигерии женщины Аба считаются национальными героями!

Национализм и независимость

Вторая мировая война (1939-1945) оказала большое влияние на Африку.Некоторые важные сражения произошли в Северной Африке. Многие африканцы из французских и британских колоний также были завербованы для борьбы на стороне союзников в Европе, Азии и Северной Африке. При вербовке африканских солдат британцы и французы подчеркивали, что солдаты будут помогать защищать мир от зла ​​фашизма и нацизма. В конце войны вернувшиеся солдаты задали важный вопрос: «Почему я должен отдавать свою жизнь, чтобы сохранить Европу и Америку свободными, если я не свободен в своей собственной стране?» Для обычного африканца жизнь как колониального подданного была едва ли лучше, чем жизнь при фашизме или нацизме.

Более того, вернувшиеся ветераны и другие африканцы также знали об обещании, данном в Атлантической хартии . В 1941 году премьер-министр Великобритании Уинстон Черчилль и президент США Франклин Рузвельт составили документ, Атлантическая хартия , в котором излагались принципы, которыми руководствовались военные усилия союзников. Третий параграф Хартии гласит, что союзники « уважают право всех народов выбирать форму правления, при которой они будут жить; и они захотят, чтобы суверенные права на самоуправление были восстановлены для тех, кто был их насильственно лишен. »Неудивительно, что африканцы заявили об этом как об обязательстве союзников (по крайней мере, Великобритании) положить конец колониальному правлению в Африке.

Сразу после войны в других частях света происходили большие изменения. Европейские колонии в Азии потребовали и заслужили независимость от Европы. Особое значение имела независимость Индии и Пакистана от Великобритании в 1947 году. Многие африканцы смотрели на Индию как на пример того, что политически возможно для их собственных стран.

В конце 1940-х — начале 1950-х годов почти в каждой африканской колонии было создано новых массовых политических партий. В отличие от прежних политических организаций, эти партии не ограничивались образованной элитой. Они хотели и нуждались в массовой поддержке своего дела. Причина вышла за рамки требований о расширении возможностей и прекращении дискриминации. Центральным требованием было политическая свобода, конец колониального правления! Быстрый рост африканского национализма застал европейские колониальные державы врасплох.Итальянцы и британцы, а затем французы, а затем и упорные бельгийцы, в конце концов откликнулись на требования независимости.

Ливия (1951 г.) и Египет (1952 г.) были первыми африканскими странами, получившими независимость. Гана (Голд-Кост) в 1957 году была первой страной к югу от Сахары, получившей независимость. 1960 год стал важным годом для африканской независимости. Как указано на прилагаемой карте ( Щелкните на карте: Независимость Африки, ), четырнадцать африканских стран обрели независимость в 1960 году.К 1966 году все африканские страны, кроме шести, были независимыми национальными государствами.

Хотя движение к независимости после войны было довольно быстрым, оно не произошло без борьбы. К счастью, в большинстве стран, завоевавших независимость к 1966 году, борьба в основном носила ненасильственный характер. К сожалению, этого не произошло с шестью оставшимися африканскими колониями.

Борьба за национальное освобождение

В конце 1960-х годов осталось шесть африканских колоний. Из шести пять были колониями поселенцев, то есть колониями, в которых власть интересов европейского сообщества поселенцев не позволяла большинству африканского населения обрести политическую свободу.Из этих шести стран пять находились в южной части Африки: Ангола (Португалия / поселенец), Мозамбик (Португалия / поселенец), Намибия (Южная Африка / поселенец), Южная Африка (поселенец) и Зимбабве (британец / поселенец). Небольшая португальская колония Гвинея-Бисау и Кабо-Верде в Западной Африке была шестой колонией.

Как и в других африканских колониях, африканские националистические движения сформировались в каждой из этих стран в 1940-х и 1950-х годах. Эти политические партии стремились к мирным конституционным изменениям. То есть основной целью националистических партий было изменить конституции колоний поселенцев, чтобы признать права большинства африканского населения.Одним из популярных лозунгов этих партий было требование Один человек, один голос . Знакомо ли это политическое требование? Должно! Это похоже на требования, выдвинутые более 200 лет назад лидерами американской революции.

В течение многих лет белые поселенцы в этих колониях имели право голоса. Они использовали это голосование для избрания представителей, принимавших законы, защищавшие власть европейских поселенцев и дискриминирующие африканцев. Лидеры африканских националистов считали, что если франшиза была правом всех граждан, большинство населения использовало бы свой голос, чтобы установить независимое африканское правление большинства.

Колониальные правительства поселенцев ответили на ненасильственные конституционные требования африканских националистических партий законами, запрещающими любые политические протесты, и насилием. Репрессивные законы позволили правительствам поселенцев арестовывать и заключать в тюрьму лидеров запрещенных африканских политических партий. Самым известным из заключенных политических лидеров является Нельсон Мандела, лидер Африканского национального конгресса ЮАР , который провел 27 лет в тюрьме, прежде чем был освобожден в 1989 году.В 1994 году он стал первым президентом независимой Южной Африки. Однако Мандела был лишь одним из многих африканских лидеров, которые провели годы в тюрьме из-за своих требований свободы, правления большинства и независимости своих стран.

Нельсон Мандела

Как африканские националистические политические партии отреагировали на заключение своих лидеров и запрет на любую политическую деятельность? Их реакция была очень похожа на реакцию американцев более 200 лет назад.Как и лидеры американской революции, африканские националисты решили, что единственный способ справиться с репрессивными режимами, которые применяют силу и насилие, — это сопротивляться силой. Начиная с начала 1960-х годов запрещенные националистические партии в каждой колонии поселенцев преобразовались в освободительных движений для вооруженной борьбы с режимами поселенцев.

Переход к вооруженной борьбе был нелегким. Вооруженные силы режимов поселенцев были хорошо оснащены и хорошо обучены.Со своей стороны, у новообразованных освободительных движений было мало денег на покупку оружия и обучение солдат. Более того, когда освободительные движения обращались за помощью к внешнему миру, ни Соединенные Штаты, ни бывшие колониальные державы в Европе не хотели их поддерживать. Откуда пришла поддержка? В основном из Китая, бывшего Советского Союза и их союзников в Восточном блоке . Модуль 10: Африканская политика и правительство предоставляет подробную информацию о том, как холодная война (1945-1990) между Соединенными Штатами и их союзниками ( Западный блок, ) и Советским Союзом и его союзниками ( Восточный блок, ) повлияла на движения. за освобождение в Южной Африке.

В дополнение к поддержке со стороны Восточного блока , освободительные движения в южной части Африки получили мощную поддержку со стороны независимых африканских стран. В 1963 году на встрече лидеров африканских стран, сформировавших Организацию африканского единства ( Модуль 10: Африканская политика и правительство, ), Кваме Нкрума, весьма уважаемый президент Ганы, заявил, что «ни один африканец не будет свободным до тех пор, пока не будет. Африканцев на свободе ». В то время как O.A.U. и большинство африканских стран поддерживало освободительную борьбу в южной части Африки, самая прямая поддержка пришла из прифронтовых государств , независимых африканских стран, граничащих с южной частью Африки.Эти государства предоставили некоторую денежную помощь, но, что наиболее важно, они предоставили военные базы для тренировок, с которых освободительные движения могли проводить атаки. Ангола, Мозамбик и Замбия пострадали от атак режима поселенцев из-за этой помощи.

Несмотря на то, что потребовалось много лет борьбы, жертв и страданий, все колонии поселенцев завоевали свою независимость. Южная Африка в 1994 году стала последней африканской колонией, добившейся правления большинства.

В следующей таблице представлена ​​информация о борьбе в каждой стране.

ОСВОБОДИТЕЛЬНЫЕ ДВИЖЕНИЯ В АФРИКЕ

Ваша очередь:

Письменное упражнение : Выполните ОДНО из следующих ДВУХ письменных заданий.

1. История современной Африки имеет некоторое сходство с историей Соединенных Штатов. США были колонией европейской державы, как и все африканские страны, за исключением Эфиопии и Либерии. Основываясь на информации, предоставленной в последних трех учебных заданиях этого модуля, и на том, что вы уже узнали об истории колониальной эпохи в США.S. history, напишите небольшой очерк, в котором вы сравните и противопоставите колониальный опыт Соединенных Штатов и Африки.

2. Представьте, что вы газетный репортер. Ваше задание — освещать националистическое движение в африканской стране (вы сами выбираете, в какой стране!). Используя информацию, полученную с одного из перечисленных ниже веб-сайтов или из энциклопедий в вашей школьной библиотеке, напишите газетный отчет, в котором вы опишете борьбу за независимость в выбранной вами стране.Чтобы помочь вам подумать о том, каким может быть международный отчет из африканской страны, вы можете прочитать международную статью в американской газете. Вы можете сделать это, зайдя в школьную библиотеку или посетив веб-сайт газеты (веб-сайты важных газет США перечислены на странице Exploring Africa Current Events .

Один из наиболее полных веб-ресурсов по отдельным странам можно найти на сайте Библиотеки Конгресса США по изучению стран:

http: // память.loc.gov/frd/cs/

Еще один хороший веб-ресурс по истории Африки, включая историю движений за независимость, был создан Британской радиовещательной корпорацией. Их веб-сайт The Story of Africa можно найти по адресу:

http://www.bbc.co.uk/worldservice/africa/features/storyofafrica/

После того, как вы определили свою страну, вам также следует поискать в Интернете историческую информацию о вашей стране. Воспользуйтесь одной из стандартных поисковых систем и введите свою тему, например «история Ганы.«Почти наверняка вы найдете один или несколько сайтов с информацией о борьбе за независимость в выбранной вами стране.

Это последнее действие в этом модуле. Вернитесь к учебной программе, перейдите к модулю 8 или перейдите к одному из заданий в этом модуле

Преодоление первичной и приобретенной устойчивости к терапии анти-PD-L1 путем индукции и активации находящихся в опухоли cDC1

Чувствительность к блокаде PD-L1 коррелирует с плотностью инфильтратов CD8

+ Т-лимфоцитов

Противоопухолевый эффект анти-PD -L1-терапию оценивали на четырех моделях сингенных опухолей мышей: аденокарцинома толстой кишки MC38, меланома B16 и два трижды отрицательных рака молочной железы: AT-3, полученный из модели PyMT-MMTV на фоне H-2 b и 4T1 на фоне H-2 d фон.Лечение задерживало рост опухолей MC38, но не опухолей AT-3, B16 или 4T1 (дополнительный рисунок 1a). Иммуногистохимический анализ (ИГХ) выявил редкие CD8 + Т-клетки, но большое количество CD163 + ассоциированных с опухолью макрофагов (ТАМ) в опухолях AT-3, B16 и 4T1 по сравнению с опухолями MC38 (дополнительный рисунок 1b), что соответствует положительная корреляция между частотой CD8 + инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) и ответом на терапию анти-PD-L1 2 , а также подтверждение опухолей AT-3, B16 и 4T1 в качестве моделей для плохо инфильтрированных Т-клетками опухолей, резистентных к анти-PD-L1 терапия.

ISIM со стимуляцией Flt3L, RT и TLR3 / CD40 способствует праймированию, размножению и инфильтрации опухолеспецифических Т-клеток в опухолях с низкой инфильтрацией Т-лимфоцитов

Использование трех ортотопических мышиных моделей опухолей с недостаточной инфильтрацией Т-лимфоцитов (AT-3, B16 и 4T1), мы оценили эффективность комбинаторной терапевтической схемы, ISIM, состоящей из внутриопухолевого последовательного введения Flt3L (для привлечения cDC1 в TME), RT (для индукции иммуногенной гибели раковых клеток и созревания DC) и TLR3. / Агонисты CD40 (для стимуляции нагруженных антигеном cDC1 для примирования и размножения опухолеспецифических Т-клеток CD8 + ) (рис.1а).

Рис. 1: Иммуномодуляция in situ (ISIM) с помощью Flt3L, лучевая терапия (RT) и стимуляция TLR3 / CD40 способствует праймированию, размножению и инфильтрации опухолеспецифических Т-клеток в опухоли, плохо инфильтрованные Т-клетками.

a Экспериментальная установка. Мышам, несущим опухоли AT-3, B16 или 4T1, вводили внутриопухолевую инъекцию Flt3L с последующей RT и стимуляцией TLR3 / CD40 in situ. Было указано время отбора образца в каждом эксперименте. b Типичные графики проточной цитометрии, показывающие экспрессию CD103 и CD11b на Ly6c класс II + CD11c + CD24 + F4 / 80 DC и частоту общих DC, CD11b + DC, CD103 + DC среди клеток CD45 + и соотношение CD103 + DC / CD11b + DC в опухолях AT-3. n = 5 мышей на группу. c Репрезентативные графики проточной цитометрии и частота клеток CD40 hi CD86 hi среди CD103 + DC в опухолях AT-3. n = 6 мышей на группу. d Частота GFP + CD103 + DC среди клеток CD45 + в опухолях AT-3, обработанных агонистами Flt3L + RT или Flt3L + RT + TLR3 / CD40. n = 5 мышей на группу. e Репрезентативные изображения клеток CD11c + CD103 + GFP + в лимфатических узлах, дренирующих опухоль (TdLN) мышей, несущих AT-3-GFP, получавших ISIM, полученные с помощью проточной цитометрии.На панели данных показана частота GFP + CD11c + CD103 + клеток (CD103 + DC) из всех клеток в TdLN мышей, обработанных агонистами Flt3L + RT или Flt3L + RT + TLR3 / CD40. n = 5 мышей на группу. Все панели имеют одинаковое увеличение, масштабная линейка = 10 мкм. f Типичные графики проточной цитометрии и частота тетрамера gp70 (Tet) + CD8 + Т-клеток среди CD8 + Т-клеток в TdLN от мышей с опухолью 4T1. n = 5 мышей (NT) и 13 мышей (ISIM). g Частота CD8 + Т-клеток среди CD45 + клеток в опухолях AT-3, B16 и 4T1. n = 4 мыши (ISIM опухолей B16) и 5 ​​мышей (любые другие группы). h , i Типичный график проточной цитометрии и частота Tet + CD8 + T-клеток ( h ) и Pmel-1 T-клеток (CD90.1 + CD8 + ) ( я ). h n = 8 мышей (NT) и 5 ​​мышей (ISIM), i n = 3 мыши (NT) и 4 мыши (ISIM).Представленные данные являются репрезентативными для двух ( b f , h ) или трех ( g ) независимых экспериментов. Двусторонний t -тест ( b i ). Среднее ± SEM. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

ISIM-индуцированные изменения TME оценивали с помощью проточной цитометрии (дополнительный рис. 2), как ранее описано другими 3 . Ежедневное введение Flt3L in situ в течение 9 дней увеличивало CD103 + DC в опухолях AT-3, периферической крови (PB) и лимфатических узлах (LN), включая дренирующий из опухоли LN (TdLN) и мезентериальный LN (mLN) (рис.1b и дополнительный рис. 3a) в соответствии с недавним исследованием лимфомы 14 . CD11b + DC опухоли также увеличились, но более высокое соотношение CD103 + / CD11b + DC предполагает предпочтительную мобилизацию DC CD103 + . Примечательно, что Flt3L не изменяет частоту Т-клеток CD8 + или миелоидных клеток CD11b + , включая ТАМ, и не влияет на рост опухоли (дополнительный рис. 3b, c). Локальное облучение однократной дозой 9 Гр увеличивало экспрессию CD40 и CD86 на ДК CD103 + , предполагая созревание Flt3L-индуцированных находящихся в опухоли ДК CD103 + (рис.1в).

Мигрирующие CD103 + DC являются доминирующими клетками, несущими антиген к TdLN 4 , но как этот процесс может быть усилен, неизвестно. С этой целью мышей, несущих опухоли AT-3, экспрессирующие GFP (AT-3-GFP), обрабатывали инъекциями in situ агонистов TLR3 / CD40 или фосфатно-солевого буфера (PBS) после введения Flt3L и RT, и собирали опухоли и TdLN. через 24 ч. Стимуляция TLR3 / CD40 in situ уменьшала внутриопухолевые GFP + CD103 + DC (рис.1г). Одновременно с этим, визуализирующий анализ проточной цитометрии TdLN выявил повышенное количество DC GFP + CD103 + у обработанных мышей по сравнению с контрольными PBS (рис. 1e), что согласуется с эффективным переносом cDC1, нагруженных опухолевым антигеном (TAA). к TdLN за счет стимуляции TLR3 / CD40. Более того, мы обнаружили повышенное присутствие GFP + CD103 + DC / CD8 + дублетов Т-клеток (дополнительный рис. 4a, b), что свидетельствует о перекрестном взаимодействии между загруженными TAA cDC1 и CD8 + T клетки.В соответствии с этим, значительная повышающая регуляция CD69 наблюдалась как на CD4 + , так и на CD8 + Т-клетках в TdLN, что указывает на эффективную активацию Т-клеток (дополнительный рисунок 5). Эти результаты побудили нас оценить, способствует ли ISIM праймированию опухолеспецифических Т-клеток CD8 + с использованием тетрамера (Tet) для идентификации H-2L d -ограниченных MuLV gp70-специфических CD8 + Т-клеток у мышей, несущих 4T1. опухоль, которая несет эпитопы gp70 в виде эндогенного TAA 25 .В TdLN ISIM способствовал генерации Tet + CD8 + Т-клеток (рис. 1f), которые подавляли CD62L (L-селектин) и были способны продуцировать IFN-γ и TNF-α (дополнительный рис. 6), что соответствует с эффекторным фенотипом.

Анализ циркулирующих Т-клеток CD8 + и CD4 + показал, что комбинация стимуляции Flt3L / RT или TLR3 / CD40 увеличивала субпопуляции CD44 + CD62L + Т-клеток центральной памяти (T CM ) (Дополнительный рис.7а, б). Однако генерация субпопуляций CD44 + CD62L эффекторных Т-клеток памяти (T EM ) и усиление экспрессии PD-1 были значительно усилены объединением всех компонентов ISIM (дополнительный рисунок 7b). Кроме того, мыши, получавшие ISIM, содержали больше циркулирующих Т-клеток CD8 + , экспрессирующих 4-1BB и CX3CR1, маркер эффекторной дифференцировки 26,27 (дополнительный рис. 7c), и эти маркеры преимущественно экспрессировались в Tet + . CD8 + Т-клетки у мышей с опухолью 4T1 (дополнительный рис.7г). Важно отметить, что ISIM увеличивал частоту TIL CD8 + во всех трех моделях опухолей, что соответствовало преобразованию слабо воспаленных Т-клеток в опухоли, воспаленные Т-клетками (рис. 1g). В соответствии с примированием опухолеспецифических Т-клеток CD8 + , идентифицированных в TdLN мышей с опухолью 4T1, ISIM увеличивал частоту Tet + CD8 + Т-клеток в PB и опухоли по сравнению с необработанными мышами (рис. 1ч). Чтобы подтвердить эти результаты, мы адоптивно перенесли наивные Т-клетки Pmel-1 CD8 + , которые могут распознавать gp100, экспрессированный на меланомах В16 28 , мышам, несущим опухоли В16, и обработали их ISIM.Более разросшиеся Т-клетки Pmel-1 CD8 + наблюдались в PB и опухоли у мышей, получавших ISIM, по сравнению с необработанными мышами (фиг. 1i). В совокупности эти данные указывают на эффективную перекрестную презентацию, праймирование, экспансию и инфильтрацию опухолеспецифических Т-клеток в TME посредством ISIM.

ISIM запускает регрессию уже сформировавшихся опухолей, плохо инфильтрованных Т-клетками, и улучшает выживаемость

Затем мы исследовали, может ли ISIM вызвать регресс уже установленных опухолей, плохо инфильтрированных Т-клетками, устойчивых к терапии анти-PD-L1.Быстрое уменьшение объема опухоли наблюдалось в течение одного дня после стимуляции TLR3 / CD40 у мышей с опухолями AT-3 и B16 по сравнению с необработанными мышами (фиг. 2a). Эта быстрая регрессия опухоли также наблюдалась у мышей BALB / c, получавших ISIM, с опухолями 4T1, экспрессирующими люциферазу (4T1-luc) (фиг. 2b). Оценка противоопухолевого эффекта только стимуляции in situ Flt3L, RT или TLR3 / CD40, любой комбинации этих двух или комбинации всех трех компонентов продемонстрировала, что, в то время как умеренная задержка роста опухоли и улучшение выживаемости наблюдались после лечения RT или CD40 Стимуляция только / TLR3 по сравнению с отсутствием лечения, регресса установленных опухолей не обнаружено (рис.2в, г). Внутриопухолевое введение Flt3L либо с RT, либо со стимуляцией CD40 / TLR3 не влияло на рост или выживаемость опухоли; однако это произошло только в сочетании с обеими процедурами одновременно. Важно отметить, что лечение всеми тремя компонентами комбинированного режима требовалось для запуска надежной регрессии установленных опухолей AT-3, замедленного роста опухоли и увеличения выживаемости.

Рис. 2: Иммуномодуляция in situ (ISIM) запускает быструю регрессию сформировавшихся опухолей, плохо инфильтрированных Т-клетками, и улучшает выживаемость.

a Индивидуальные кривые объема опухоли у мышей с опухолью AT-3 (верхний) и B16 (нижний), получавших PBS (NT) или ISIM. n = 7 мышей на группу (AT-3) и 9 мышей на группу (B16). b Биолюминесцентная визуализация мышей с опухолью 4T1-luc, получавших PBS (NT) или ISIM ( n = 5 мышей на группу) на день 14. На панели данных показано среднее сияние в каждый момент времени, как указано. Статистическая значимость определялась двусторонним тестом t . c , d графики водопада ( c ), кривые объема опухоли (среднее значение) и кривые выживаемости ( d ) у мышей с опухолью AT-3 при различном лечении, как указано. Графики водопада показывают максимальное изменение объема опухоли в день введения агонистов TLR3 / CD40. n = 7 мышей (PBS, Flt3L, RT, TLR3 / CD40) и 8 мышей (любые другие группы). * p <0,05, *** p <0,001 по логранговому критерию. и Кривые объема опухоли (среднее значение) и масса опухоли (мг) у мышей, несущих опухоль AT-3.Flt3L вводили внутрибрюшинно (i.p.) или внутриопухолево (i.t.) с последующим RT и агонистами TLR3 / CD40. n = 5 мышей (NT) и 6 мышей (любые другие группы). f Кривые первичного объема опухоли (средние) и масса опухоли (мг) у мышей, несущих двусторонние опухоли AT-3. Для установления отдаленных опухолей клетки AT-3 имплантировали на левую сторону через 2 дня после инъекции в жировую подушку правой молочной железы (день 0). n = 5 мышей (NT) и 6 мышей (любые другие группы). Первичные опухоли собирали через 7 дней после стимуляции TLR3 / CD40 ( e , f ).Данные, представленные в a d , представляют три независимых эксперимента. ** p <0,01, *** p <0,001 односторонним дисперсионным анализом с множественными сравнениями Тьюки ( e , f ). Среднее ± SEM. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Предыдущие исследования показали, что системное введение Flt3L усиливает иммунотерапию на доклинических моделях 11,12,13 . Хотя внутриопухолевая доставка Flt3L оказалась лучше системного введения в привлечении DC к TME и TdLN 14 , остается неизвестным, влияет ли это на контроль опухолей, плохо инфильтрированных Т-клетками.У мышей с опухолью AT-3 мы обнаружили, что внутриопухолевое введение Flt3L более эффективно контролировало рост опухоли, чем системная инъекция в сочетании с RT и стимуляцией TLR3 / CD40 in situ (фиг. 2e). Мы также исследовали, нужно ли доставлять RT в ту же опухоль, получая инъекции агонистов Flt3L и TLR3 / CD40. С этой целью мы облучали первичную или отдаленную опухоль в сочетании с введением in situ агонистов Flt3L и TLR3 / CD40 в первичную опухоль мышей, несущих двусторонние опухоли AT-3.Рост первичных опухолей, получавших in situ агонисты Flt3L и TLR3 / CD40, не был изменен облучением удаленных опухолей (фиг. 2f), что подчеркивает необходимость нацеливания на ту же опухоль для достижения максимального контроля опухоли с помощью ISIM.

ISIM меняет соотношение клеток CD8

+ / CD11b + в опухоли и делает опухоли, плохо инфильтрованные Т-клетками, чувствительными к терапии анти-PD-L1

Высокая плотность миелоидных клеток и ТАМ ассоциируется с плохим прогнозом, и устойчивость к блокаде ПД-1 29,30 .Фенотипический анализ опухолей AT-3, B16 и 4T1 показал, что ISIM-опосредованное увеличение TIL CD8 + было связано с сопутствующим уменьшением миелоидных клеток CD11b + и TAM, что привело к обращению CD8 + Соотношение клеток / CD11b + (рис. 3а, б).

Рис. 3. Иммуномодуляция in situ (ISIM) меняет соотношение клеток CD8 + / CD11b + и делает опухоли, плохо инфильтрованные Т-клетками, чувствительными к терапии анти-PD-L1.

a Типичные графики проточной цитометрии, показывающие экспрессию CD11b и CD8 всех клеток CD45 + в опухолях AT-3.Панели данных показывают частоту клеток CD11b + из клеток CD45 + и соотношение CD8 + Т-клеток / CD11b + клеток в опухолях AT-3, B16 и 4T1. n = 4 мыши (ISIM B16) и 5 ​​мышей (любые другие группы). b Частота Ly6c класс II + CD24 F4 / 80 + опухолевые макрофаги (ТАМ) среди клеток CD45 + в опухолях AT-3, B16 и 4T1. n = 4 мыши (ISIM B16) и 5 ​​мышей (любые другие группы).c Типичная гистограмма, показывающая экспрессию PD-1 и процентное содержание клеток PD-1 + в TIL CD8 + в опухолях AT-3, B16 и 4T1. n = 5 мышей (все группы AT-3, ISIM 4T1), 6 мышей (NT 4T1), 7 мышей (NT B16) и 8 мышей (ISIM B16). d Процент клеток PD-1 + в gp70-специфических Tet или Tet + CD8 + Т-клеток в опухолях 4T1, обработанных ISIM. n = 5 мышей на группу. e , f Типичная гистограмма, показывающая экспрессию PD-L1 и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) PD-L1 в опухолевых клетках CD45 GFP + AT-3 ( e ) и ТАМ в AT- Опухоли 3, B16 и 4T1, обработанные с ISIM или без него ( f ). n = 4 мыши (ISIM B16) и 5 ​​мышей (любые другие группы). Опухоли собирали через 5-7 дней после стимуляции TLR3 / CD40 ( a f ). Двусторонний t -тест ( a f ). g Кривые роста опухоли (средние) и кривые выживаемости у мышей, несущих опухоль AT-3, B16 и 4T1, в различных группах лечения, как указано. n = 5 мышей (все группы AT-3, αPD-L1 B16 и ISIM + изотип Ab B16) и n = 6 (любые другие группы) * p <0.05, ** p <0,01, *** p <0,001 по логранговому критерию. Показанные данные являются репрезентативными для двух ( d , e , g ) или трех ( a c , f ) независимых экспериментов. Среднее ± SEM. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Активация локальной оси подавления иммунитета PD-1 / PD-L1 была связана с присутствием TIL CD8 2 . Наблюдая индуцированное ISIM увеличение инфильтрации Т-клеток CD8 + , мы оценили экспрессию PD-1 на TIL CD8 + .Частота экспрессии PD-1 CD8 + TIL увеличивалась в опухолях AT-3, B16 и 4T1 (рис. 3c), а экспрессия PD-1 была более преобладающей в Tet + CD8 + T-клетках, чем Tet. CD8 + Т-клетки (рис. 3d), что свидетельствует о более высокой чувствительности к PD-L1-опосредованному ингибированию индуцированных ISIM опухолеспецифических инфильтратов CD8 + Т-клеток.

Повышающая регуляция PD-L1 в опухолях и инфильтрирующих опухоль иммунных клетках представляет собой механизм адаптивного иммунного сопротивления, который коррелирует с ответом на терапию анти-PD-1 / PD-L1 31,32 .Таким образом, мы оценили экспрессию PD-L1 на опухолевых клетках мышей с опухолью AT-3-GFP, получавших или не получавших ISIM. ISIM увеличивал экспрессию PD-L1 на опухолевых клетках CD45 GFP + (фиг. 3e). Кроме того, ISIM увеличивал экспрессию PD-L1 на ТАМ во всех трех моделях опухолей (фиг. 3f).

Достигнув конверсии опухолей, плохо инфильтрированных Т-клетками, и активации оси PD-1 / PD-L1 в TME, мы попытались проверить, увеличивает ли ISIM противоопухолевую эффективность терапии анти-PD-L1.Опухоли, обработанные ISIM, стали чувствительными к терапии анти-PD-L1, что привело к замедлению роста опухоли и повышению выживаемости во всех трех моделях опухолей (рис. 3g). В совокупности эти результаты обеспечивают доказательство концепции о том, что индукция и активация in situ cDC1, находящихся в опухоли, преобразует опухоли, плохо инфильтрованные Т-клетками, и делает их чувствительными к терапии анти-PD-L1.

Преобразование опухолей с низкой инфильтрацией Т-лимфоцитов требует двойной стимуляции TLR3 / CD40 индуцированных Flt3L

Затем мы исследовали роль комбинированной стимуляции TLR3 / CD40 индуцированных Flt3L DC в преобразовании опухолей с плохой инфильтрацией Т-лимфоцитов. .Мы лечили мышей с опухолью AT-3 агонистическими анти-CD40 Ab, поли (I: C) или их комбинацией после введения Flt3L и RT. В то время как мыши, обработанные агонистом CD40 или TLR3, отвечали умеренной задержкой роста опухоли и повышенной выживаемостью, комбинированная стимуляция TLR3 / CD40 приводила к превосходному контролю над опухолью и выживаемости во всех трех моделях опухолей (фиг. 4a и дополнительный фиг. 8). Двойная стимуляция TLR3 / CD40 требовалась для усиления CD40, CD70 и CD86 на DC CD103 + в TdLN (рис.4б). Фенотипический анализ циркулирующих Т-клеток показывает, что стимуляция агонистом TLR3 увеличивала Т-клетки CM , CD8 + и CD4 + ; однако агонист CD40 требовался для их дифференцировки в T EM и активации PD-1, 4-1BB и CX3CR1, которые дополнительно усиливались двойной стимуляцией TLR3 / CD40 (дополнительный рисунок 9). Важно отметить, что комбинированная стимуляция TLR3 / CD40 была необходима для увеличения частоты TIL CD8 + в опухолях AT-3 и опухолеспецифических T-клеток Tet + CD8 + в опухолях PB и 4T1 (рис.4в). Кроме того, изменение состава иммунных клеток TME (уменьшение миелоидных инфильтратов, изменение соотношения клеток CD8 + / CD11b + и усиление регуляции PD-L1 в TAM) наблюдалось только при сочетании TLR3 / CD40. стимуляция (рис. 4d, e и дополнительный рис. 10). Вместе эти результаты указывают на критическую роль двойной стимуляции in situ TLR3 / CD40 индуцированных CD103 + DC в ремоделировании TME, плохо инфильтрованного Т-клетками.

Рис. 4: Преобразование опухолей, плохо инфильтрированных Т-клетками, требует двойной стимуляции TLR3 / CD40 индуцированных Flt3L DC.

a Кривые объема опухоли (средние) и кривые выживаемости у мышей с опухолью AT-3 в различных группах лечения, как указано. n = 7 мышей во всех группах. ** p <0,01, *** p <0,001 по логранговому критерию. b Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CD40, CD70 и CD86 в DC CD103 + в дренирующих опухоль лимфатических узлах (TdLN) мышей с опухолью AT-3. n = 5 мышей (NT), 7 мышей (Flt3L + RT + TLR3, Flt3L + RT + CD40) и 8 мышей (Flt3L + RT + TLR3 / CD40). c Частота CD8 + Т-клеток CD45 + клеток в опухолях AT-3 и частота gp70-специфических Tet + клеток среди CD8 + Т-клеток в периферической крови и их количество (на грамм) gp70-специфических клеток Tet + в опухолях мышей с опухолью 4T1. n = 5 мышей (NT), 8 мышей (Flt3L + RT + TLR3, Flt3L + RT + CD40) и 9 мышей (Flt3L + RT + TLR3 / CD40) для CD8 Т-клетки + в опухолях AT-3 . n = 5 мышей (NT) и 6 мышей (любые другие группы) для клеток Tet + . d , e Частота CD11b + клеток из CD45 + клеток, соотношение CD8 + Т-лимфоцитов / CD11b + клеток и частота ассоциированных с опухолью макрофагов (ТАМ: Ly6c — класс II + CD24 F4 / 80 + ) клеток CD45 + ( d ) и MFI PD-L1 в TAM ( e ) в опухолях AT-3. n = 5 мышей (NT) и 8 мышей (любые другие группы). Опухоли собирали через 5-7 дней после стимуляции TLR3 / CD40 ( b e ).NS не значимо, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 односторонним дисперсионным анализом с множественными сравнениями Тьюки ( b e ). Показанные данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. Среднее ± SEM. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

ISIM первичных опухолей запускает иммунное ремоделирование и регрессию нелеченных отдаленных опухолей

Чтобы определить, может ли ISIM-индуцированный адаптивный Т-клеточный иммунитет вызывать системный противоопухолевый иммунитет, абсорбционный эффект ISIM проявился только на одной опухоли у мышей с двусторонним AT Было исследовано 3 опухоли.ISIM привел к быстрой регрессии не только обработанных опухолей, но и нелеченных отдаленных опухолей (рис. 5а). Кроме того, ISIM-индуцированное иммунное ремоделирование TME было очевидным в отдаленных опухолях, а также в обработанных опухолях (фиг. 5b), что подтверждено качественным анализом IHC (фиг. 5c). Эти результаты показывают, что ISIM генерирует мощный системный противоопухолевый иммунитет, вызывая иммунное ремоделирование и регресс нелеченных отдаленных опухолей.

Рис. 5: Иммуномодуляция in situ (ISIM) первичных опухолей запускает иммунное ремоделирование и регресс нелеченных отдаленных опухолей.

a Кривые роста опухоли (средние) и графики водопада первичных и нелеченных отдаленных опухолей мышей, несущих опухоль AT-3, обработанных с или без ISIM. n = 9 мышей (NT) и 10 мышей (ISIM). Графики водопада показывают максимальное изменение объема опухоли в день введения агонистов TLR3 / CD40. *** p <0,001 по двустороннему тесту t . b Частота CD8 + Т-клеток, CD11b + клеток среди CD45 + клеток и CD8 + Т-клетки / соотношение CD11b + клеток, частота ассоциированных с опухолью макрофагов (ТАМ: Ly6c класс II + CD24 F4 / 80 + ) клеток CD45 + , процент клеток PD-1 + в TIL CD8 + и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) PD -L1 в ТАМ в первичных и отдаленных опухолях, обработанных с помощью или без ISIM для первичных опухолей. n = 5 мышей (NT) и 7 мышей (ISIM). c Репрезентативные изображения иммуногистохимии для CD8 и CD163 в первичных и необработанных отдаленных опухолях AT-3. Шкала 100 мкм. Панели данных показывают среднее количество CD8- и CD163-положительных клеток на каждое поле высокой мощности (HPF) в пяти различных областях. Опухоли собирали через 7 дней после стимуляции TLR3 / CD40 ( b , c ). Двусторонний т. -тест. Среднее ± SEM. Показанные данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов.Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

ISIM уменьшает M2-подобные макрофаги и увеличивает IL-12

+ DC в TME

Затем мы выполнили секвенирование одноклеточной РНК (scRNAseq) для оценки транскрипционных и функциональных изменений популяций иммунных клеток, инфильтрирующих опухоли AT-3, подвергнутые лечению. с ISIM, анти-PD-L1 Ab или обоими. Контрольные мыши получали изотип Ab (NT). Анализ scRNAseq инфильтрирующих опухоль клеток CD45 + дал данные для 2470–3768 высококачественных клеток на группу (всего 12 228 клеток) (дополнительный рис.11). Неконтролируемый кластерный анализ и последующие процедуры аннотации типов клеток и дифференциальной экспрессии выявили 12 лимфоидных кластеров, 2 кластера макрофагов (кластер (C) 1 и C11) и небольшие кластеры моноцитов / DC (C14), DC (C15, C16 и C18), нейтрофилы (C17) и B-клетки (C19) (фиг. 6a, дополнительные рисунки 12 и 13a и дополнительные данные 1). В опухолях, обработанных ISIM, частота макрофагов была значительно снижена, а количество Т-клеток увеличено по сравнению с контрольными опухолями (рис.6b, c и дополнительный рис. 13b) в соответствии с результатами проточной цитометрии (рис. 3b) и ИГХ (рис. 5c). Кластеры макрофагов (C1 и C11) экспрессировали Arg1, Mrc1 и Ccl8 , но были в основном отрицательными для Nos2 , что согласуется с M2-подобными ТАМ (рис. 6d) 29,30,33 .

Рис. 6: Кластеризация инфильтрирующих опухоль иммунных клеток и анализ популяций миелоидных клеток с помощью scRNAseq.

a UMAP-графики инфильтрирующих опухоль иммунных клеток (CD45 + клеток) в опухолях AT-3.Кластеры 1 (C1), 11 (C11) и 15–18 (C15-18) были идентифицированы как миелоидные клетки для дальнейшего анализа ( c f ). b Распределение типа клеток в опухолях AT-3, обработанных PBS + Ab изотипа (NT), PBS + Ab против PD-L1 (αPD-L1), иммуномодуляции in situ (ISIM) + изотипа Ab (ISIM) или ISIM + анти-PD-L1 Ab (ISIM + αPD-L1). Типы ячеек на графиках UMAP выделены соответствующими цветами на панели данных. c Частота каждого миелоидного кластера в опухолях AT-3 при различном лечении, как указано.Нейтрофилы, плазматические дендритные клетки pDC. d Графики экспрессии Arg1 , Mrc1 , Ccl8 и Nos2 в кластерах миелоидных клеток. e Heatmap, отображающая нормализованную экспрессию выбранных генов в каждом кластере миелоидных клеток. Моно моноцит. f Volcano График, показывающий обогащение дифференциально экспрессируемых генов между C15 (IL-12 DC) и C16 (cDC1). Каждая красная и синяя точка обозначает отдельный ген со скорректированным по Бенджамини-Хохбергу значением p <0.05 и логарифмическое изменение кратности> 0,25. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Были идентифицированы два кластера DC (C15 и C16), которые экспрессировали Batf3, Flt3 и Zbtb46 (рис. 6e). C16 экспрессировал маркеры cDC1 ( Itgae (кодирует CD103) , Xcr1, Tlr3 и Clec9a ) и высокие уровни генов, связанных с MHC класса II ( Ciita, h3-DMb1 и h3-aa ). В опухолях, обработанных ISIM, наблюдается повышенная частота C15, который экспрессирует Fscn1 , Ly75 (DEC-205), Il12b (IL-12p40), ключевые гены неканонического пути NF-κB ( Cd40 , Birc2 , Map3k1 , Nfkb2 и Relb ) и высокие уровни маркеров созревания ( Cd70, Cd80 и Cd83 ) (рис.6c, e, f и дополнительные данные 2), что согласуется с продуцирующими IL-12 DC (IL-12 DC), которые имеют решающее значение для эффективной терапии анти-PD-1 34 .

ISIM индуцирует стволовые

Tcf7 + Slamf6 + Т-клетки в опухоли, плохо инфильтрованные Т-клетками

Из первоначального анализа общих популяций клеток мы выделили аннотированные лимфоидные кластеры. клетки, экспрессирующие Cd3e и / или Ncr1 , и повторно проанализировали данные 35 .Этот подход дал 13 отдельных лимфоидных кластеров (Ly_C) (рис. 7a, дополнительный рис. 14a, b и дополнительные данные 3). В соответствии с недавним исследованием 35 , некоторые кластеры были идентифицированы на основе функциональных маркеров, а не их клеточного происхождения. Ly_C4 и C7 включали CD4 + , CD8 + и NKT-клетки у контрольных мышей и мышей, обработанных анти-PD-L1, и в основном Т-клетки CD8 + у мышей, обработанных ISIM- и ISIM + анти-PD-L1. мышей (рис. 7b), но были отмечены повышенной экспрессией генов и путей клеточного цикла: Mki67 , Cenpa и Cks1b в Ly_C4 и Mcm3 , Mcm5, и Ung в Ly_C7 (Дополнительные рис.15, 16a и дополнительные данные 3). Ly_C2 экспрессировал Il7r, Sell, Klf2, Lef1 и Tcf7 (кодирующий Tcf-1), а также высокие уровни генов и путей рибосомных субъединиц, но не экспрессировал Pdcd1 , Lag3 и Havc ( Havc). кодирование Tim3) (рис. 7b, дополнительные рисунки 15 и 16a и дополнительные данные 3), что согласуется с наивными CD8 + Т-клетками 36,37 . Этот кластер был обнаружен в основном в контрольных опухолях и значительно уменьшился в опухолях, обработанных ISIM (рис.7в).

Фиг. 7. Идентификация популяций лимфоидных клеток, инфильтрирующих опухоль, с помощью scRNAseq.

a графики UMAP лимфоидных субпопуляций в опухолях AT-3. Правые панели показывают графики опухолей, обработанных PBS + изотипа Ab (NT), PBS + анти-PD-L1 Ab (αPD-L1), иммуномодуляции in situ (ISIM) + изотипа Ab (ISIM) или ISIM + анти-PD-. L1 Ab (ISIM + αPD-L1). b Графики экспрессии указанных генов в кластерах лимфоидных клеток в опухолях AT-3. Уровни экспрессии обозначены цветом: серый, не выражен; оранжевый, выраженный. c Частота каждого лимфоидного кластера в опухолях AT-3 при различном лечении, как указано. γδT: γδ Т-клетки, ILC: врожденные лимфоидные клетки. d Частота Tcf1 + CD8 + Т-клеток и Slamf6 + CD8 + Т-клеток среди клеток CD45 + в необработанных (NT) и обработанных ISIM опухолях AT-3. n = 5 мышей на группу. e Репрезентативные графики проточной цитометрии, показывающие экспрессию PD-1 и Slamf6 Т-клеток CD8 + в необработанных (NT) и обработанных ISIM опухолях AT-3, а также процент PD-1 Slamf6 , PD -1 int Slamf6 + , PD-1 hi Slamf6 подмножеств среди CD8 + Т-клеток. n = 5 мышей на группу. Опухоли собирали через 7 дней после стимуляции TLR3 / CD40. Двусторонний t -тест ( d , e ). Среднее ± SEM. Показанные данные ( d , e ) являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Напротив, массивный приток Slamf6 (кодирующих Ly108) клеток (Ly_C0, C6 и C10) наблюдался в ISIM-обработанных опухолях (Fig. 7a-c). Эти кластеры также экспрессировали Tcf7 , Lef1 , маркеры стволовых клеток / памяти ( Il7r, Klf2 , Cxcr3 и Cd28 ), промежуточные уровни Pdcd1 , но были относительно отрицательными для Havc пути, связанные с клеточным циклом (рис.7b, дополнительные фиг. 15, 16a и дополнительные данные 3), что указывает на истощение стволовых предшественников Т-клеток 37,38,39,40,41,42 . Ly_C0 был преобладающим ISIM-индуцированным Tcf7 + Slamf6 + Pdcd1 + CD8 + Т-клеточная популяция, экспрессирующая высокие уровни ядерного фактора Tox (рис. 7b и дополнительные данные 3) фактор транскрипции также экспрессируется на окончательно истощенных Т-клетках, но имеет решающее значение для поддержания Т-клеточных ответов CD8 + во время хронической инфекции и рака 43,44,45,46,47 .Этот кластер отличался сильным обогащением передачи сигналов Т-клеточного рецептора (TCR) / CD3 (дополнительный рис. 16a). Подобно Ly_C0, Ly_C6 также экспрессировал Tcf7 , Lef1 , Slamf6 , Pdcd1 и Tox , но был обогащен генами, стимулированными IFN (ISG), такими как Ifit1 и усиление передачи сигналов IFN (фиг. 7b, дополнительные фиг. 15 и 16a и дополнительные данные 3). Ly_C10 экспрессировал более высокие уровни Tcf7 , Lef1 , Slamf6 , Klf2 , S1pr1 и Cd28 и увеличивал частоту в ответ на терапию анти-PD-L1 (рис.7b, c, дополнительный рисунок 15 и дополнительные данные 3). Этот кластер был уникально обогащен путями гипоксии, передачи сигналов HIF-1α и метаболизма глюкозы (дополнительный рис. 16a).

И наоборот, Ly_C5 экспрессировал высокие уровни Havcr2, Pdcd1, Lag3, Entpd1 (кодирует CD39), Cd38 , Tox и Gzmb , но не хватало Tcf7 90f6 и Tcf7 Lef6, , (Рис. 7b, Дополнительный Рис. 15 и Дополнительные данные 3), что предполагает окончательно истощенные CD8 + Т-клетки 37,38,39,40,41,42 .Анализ проточной цитометрии подтвердил достоверное увеличение TIL Tcf1 + и Slamf6 + CD8 + в обработанных ISIM опухолях по сравнению с контрольными опухолями (фиг. 7d). Кроме того, TIL CD8 + в контрольных опухолях были в основном Slamf6 CD8 + с дихотомической экспрессией PD-1; PD-1 (Ly_C2) и PD-1 hi (Ly_C5), в то время как опухоли, обработанные ISIM, содержали большое количество Slamf6 + PD-1 int CD8 + TIL (Ly_C0, C6 и C10 ) (Рисунок.7д).

Терапия анти-PD-L1 увеличивала экспрессию генов, связанных с эффекторным цитокином ( Ifng , Gzmb и Gzma ), хемокином ( Ccl4 и Ccl5 ), ингибирующими рецепторами ( и Lag3 ). Ctla4 ) и факторов транскрипции ( Tox , Nr4a2 и Bhlhe40 ), а также снижение экспрессии связанного с памятью гена Il7r в Tcf7 + Lydf6 опухолей, обработанных ISIM (рис.8a, b, дополнительный рисунок 16b и дополнительные данные 4). Анализ обогащения набора генов (GSEA) дифференциальной экспрессии генов (DGE) между ISIM и ISIM + опухолями, обработанными анти-PD-L1, выявил сильную активацию сигнатур генов, связанных с TCR, NFAT, IFNG, TNF, IL2, гипоксией, HIF- 1α, и / или гликогенез / гликолиз в большинстве инфильтрирующих кластеров Т-клеток CD8 + , за исключением Tcf7 Havcr2 + Ly_C5 (рис. 8c, дополнительный рис.17 и дополнительные данные 5), что свидетельствует о минимальном эффекте терапии анти-PD-L1 на окончательно истощенные Т-клетки CD8 + в опухолях, обработанных ISIM.

Рис. 8: Блокада PD-L1 меняет форму инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, индуцированных иммуномодуляцией in situ (ISIM).

a Heatmap, отображающая нормализованную экспрессию выбранных генов в каждом кластере лимфоидных клеток в опухолях, обработанных PBS + изотип Ab (NT), PBS + анти-PD-L1 Ab (αPD-L1), ISIM + изотип Ab (ISIM) или ISIM + анти-PD-L1 Ab (ISIM + αPD-L1). b График вулкана, показывающий обогащение дифференциально экспрессируемых генов в лимфоидном кластере (Ly_C) 0 между генами, обработанными ISIM, и ISIM + αPD-L1. Каждая красная и синяя точка обозначает отдельный ген со скорректированным по Бенджамини-Хохбергу значением p <0,05 и логарифмическим изменением> 0,25. c Тепловая карта анализа обогащения набора генов (GSEA) ISIM по сравнению с NT и ISIM + αPD-L1 по сравнению с ISIM в Ly_C 0, 2, 4, 5, 6, 7, 10 и 11, показывающая нормализованную оценку обогащения (NES). Исследованы генные наборы REACTOME, PID, HALLMARK и KEGG.

Блокада PD-L1 увеличивает частоту Th2-поляризованных CD4

+ Т-клеток в опухолях, обработанных ISIM

Ly_C8 экспрессировал Gata3 и гены, связанные с цитокином типа Th3, включая Il13, Il5, Il4 и Il6 , что соответствует Th3 CD4 + Т-клеткам, в то время как Ly_C11 экспрессирует Tbx21 , а гены, связанные с цитокином Th2-типа, включая Ifng и Tnf (кодирующие TNF-α), соответствуют Th2 CD4 + Т-клеткам ( Инжир.8а и дополнительные данные 3). Регуляторные Т-клетки (Tregs), экспрессирующие Foxp3 , были идентифицированы в Ly_C9, в то время как отдельный кластер для клеток Th27 не наблюдался. Процент трех отдельных кластеров CD4 + Т-клеток (Ly_C8, C9 и C11) снизился у мышей, получавших ISIM; однако терапия анти-PD-L1 увеличивала их, в первую очередь клетки Ly_C11 Th2 у мышей, получавших ISIM (фиг. 7c). Более того, терапия против PD-L1 увеличивала экспрессию Ifng в Ly_C11 и снижала экспрессию Il13 и Il5 в Ly_C8 в опухолях, обработанных ISIM (рис.8a и дополнительный рис. 16b ) , что свидетельствует о перекосе в сторону ответа типа Th2. В соответствии с этим, терапия анти-PD-L1 активирует пути, связанные с TCR, NFAT, IFNG, IL-2, гипоксией и гликолизом в Ly_C11 (фиг. 8c и дополнительные данные 5). Взятые вместе, анализ scRNAseq выявил значительные ISIM-индуцированные изменения как в лимфоидных, так и в миелоидных клеточных компартментах опухолей, плохо инфильтрированных Т-клетками.

ISIM вызывает IFN-γ и IL-12-зависимый de novo адаптивный Т-клеточный иммунитет, опосредованный Batf3-зависимыми DC

Чтобы определить, являются ли cDC1 ключевыми для терапевтической эффективности ISIM, мы генерировали Batf3 — / — костного мозга chimera в мышей-хозяев C57BL / 6 дикого типа (WT), у которых отсутствуют миелоидные Batf3-зависимые клетки, включая CD103 + DC.Терапевтическая эффективность ISIM снизилась до уровня только RT у мышей с химерой из костного мозга Batf3 — / — , но не у мышей, восстановленных с использованием костного мозга WT, демонстрируя, что иммуномодулирующий эффект ISIM зависит от Batf3-зависимого костного мозга, полученного из костного мозга. клетки (рис. 9а). Истощение CD8 + или CD4 + Т-клеток, но не клеток NK1.1 + , снижало противоопухолевую эффективность ISIM (фиг. 9b и дополнение 18a). Интересно, что истощение Т-клеток CD4 + отменяет вызванное ISIM снижение ТАМ и их активацию PD-L1 при истощении Т-клеток CD8 + или NK1.1 + клеток нет (рис. 9в, г). Это предполагает, что как увеличение TIL CD8 + , так и CD4 + Т-клеточное уменьшение миелоидных клеток способствовали индуцированному ISIM изменению соотношения клеток CD8 + / CD11b + в TME.

Фиг. 9: Иммуномодуляция in situ (ISIM) вызывает IFN-γ и IL-12-зависимый de novo адаптивный Т-клеточный иммунитет, опосредованный Batf3-зависимыми DC.

a Кривые роста опухоли (индивидуальные) и кривые выживаемости у мышей с опухолью AT-3, восстановленных костным мозгом мышей C57BL / 6 дикого типа (WT → WT) или мышей Batf3 — / — (Batf3 / — → WT) в различных группах лечения, как указано. n = 6 мышей (ISIM WT → WT, NT Batf3 — / — → WT, RT Batf3 — / — → WT) и 7 мышей (NT WT → WT, ISIM Batf3 — / — → WT). NS не значимо, ** p <0,01 по лог-ранговому критерию. b j Кривые роста опухоли (средние) ( b , e , g ), частота опухолевых макрофагов (TAMs: Ly6c класс II + CD24 F4 / 80 + ) среди клеток CD45 + ( c , i ), частота TIL CD8 + среди клеток CD45 + ( f , h ) и медианная интенсивность флуоресценции ( MFI) PD-L1 в TAM ( d , j ) у мышей с опухолью AT-3 в различных группах лечения, как указано. n = 6 мышей (NT, неполные) и 7 мышей (Anti-CD4, Anti-CD8 и Anti-NK1.1) ( b d ), n = 4 мыши (NT, FTY720 , RT) и n = 5 мышей (ISIM + FTY720, ISIM) ( e , f ) и n = 5 мышей во всех группах ( g j ). Опухоли собирали через 7 или 8 дней после стимуляции TLR3 / CD40 ( b j ). NS не значимо, * p <0,05, ** p <0.01, *** р <0,001. Двусторонний тест t ( b , e , g ) или односторонний дисперсионный анализ с множественными сравнениями Тьюки ( c , d , f , h j ). Среднее ± SEM. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Поддерживаемый костимулирующими сигналами на DC, вовлечение CD4 + Т-лимфоцитов способствует усилению CD8 + Т-клеточного ответа во вторичных лимфоидных органах (SLO) 48,49,50 .Чтобы определить роль SLO в терапии ISIM, мышей обрабатывали контрольным носителем или FTY720 для блокирования переноса новых Т-клеток из SLO 51 . Обработка FTY720 снизила противоопухолевую эффективность у мышей, получавших ISIM (фиг. 9e и дополнительный 18b), и снизила частоту TIL CD8 + (фиг. 9f), что указывает на важность SLO как сайтов для ISIM-индуцированного прайминга.

Учитывая, что анализ scRNAseq показал увеличение TIL и DC, экспрессирующих Ifng и Il12b , соответственно, в обработанных ISIM опухолях, мы проверили, зависит ли ISIM-опосредованная противоопухолевая эффективность от IFN-γ и IL-12.Нейтрализация IFN-γ или IL-12 приводила к заметному снижению инфильтратов Т-клеток CD8 + и противоопухолевой эффективности ISIM (рис. 9g, h). Как видно из истощения CD4 + Т-клеток, как IFN-γ, так и IL-12, нейтрализующие Ab, блокировали ISIM-индуцированное снижение TAM и их активацию PD-L1 (фиг. 9i, j). Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что ISIM вызывает IFN-γ- и IL-12-зависимый de novo адаптивный Т-клеточный иммунитет, который регулируется Batf3-зависимыми DC.

Последовательный ISIM изменяет внутриопухолевый репертуар TCR и преодолевает приобретенную резистентность

Хотя мы наблюдали синергетическую противоопухолевую эффективность ISIM и терапии анти-PD-L1 (рис.3g), все обработанные мыши в конечном итоге приобрели устойчивость к терапии анти-PD-L1 и умерли от болезни. Чтобы определить, может ли подход прайм-буста преодолеть резистентность, мы повторили стимуляцию TLR3 / CD40 после ISIM. Дополнительная еженедельная стимуляция TLR3 / CD40 один или два раза после ISIM не улучшала ответ опухоли по сравнению с мышами, получавшими ISIM один раз, у мышей с опухолью AT-3 (дополнительная фигура 19a). Напротив, мы обнаружили, что повторение всех компонентов ISIM, но не сочетание любых двух компонентов ISIM, опосредовало дополнительную регрессию опухоли и улучшило выживаемость после первоначального ISIM (рис.10а).

Рис. 10: Последовательная иммуномодуляция in situ (ISIM) изменяет внутриопухолевый репертуар TCR, уничтожает неиммуногенные опухоли с помощью блокады PD-L1 и устанавливает опухолеспецифическую иммунологическую память.

a Кривые роста опухоли (средние) и кривые выживаемости у мышей, несущих опухоль AT-3, в различных группах лечения, как указано ( n = 5 мышей во всех группах). ** p <0,01 по логарифмическому критерию. Для второго и третьего лечения после первого ISIM, Flt3L или PBS вводили ежедневно через один день после стимуляции TLR3 / CD40 в течение пяти дней подряд.Агонисты RT и TLR3 / CD40 давали по порядку. b Мышей с опухолью AT-3 лечили PBS → PBS, ISIM → PBS или ISIM → ISIM. Серийные биопсии опухоли выполняли до лечения на 33 дня, после первой обработки (PBS или ISIM) на 45 день и после второй обработки (PBS или ISIM) на 55 день. ДНК из опухолевой ткани была извлечена, и был выполнен TCRseq. Значительно увеличенные (усиление) и уменьшенные (потеря) клонотипы показаны красными и синими пузырьками, соответственно, на представительных диаграммах разброса из трех независимых экспериментов.Панели данных показывают процент значительного увеличения (увеличение) или уменьшения (потеря) клонов от общего числа клонов (слева) и оценку перекрытия TCR (справа): d33 против d45 (вверху), d45 против d55 (внизу). Каждая точка представляет собой отдельное животное. Двусторонний тест t (d33 vs d45) или односторонний дисперсионный анализ с множественными сравнениями Тьюки (d45 vs d55). NS не имеет значения. Среднее ± SEM. c Кривые роста опухоли (средние и индивидуальные) и графики водопада у мышей с опухолью AT-3, получавших серийную терапию ISIM и анти-PD-L1.Графики водопада показывают максимальное изменение объема опухоли в день введения первых агонистов TLR3 / CD40. Ab против PD-L1 (αPD-L1) или изотипа Ab давали с первого дня проведения RT до тех пор, пока у обработанных мышей не выработалась очевидная устойчивость к блокаде PD-L1. n = 6 мышей (ISIMx2 + αPD-L1) и 5 ​​мышей (любые другие группы). # p <0,01 односторонним дисперсионным анализом с множественными сравнениями Тьюки с любыми другими методами лечения. d Наивных мышей и выживших мышей из эксперимента ( c ) повторно тестировали AT-3 и B16 на контралатеральном фланге на d88 (AT-3) (слева) и на спине на d102 (B16) (справа), соответственно.Среднее ± SEM. Показанные данные ( a , c ) являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных.

Предполагая, что дополнительная регрессия опухолей, устойчивых к иммунотерапии с помощью серийного ISIM, связана с восстановлением CD103 + DC в опухоли и облегчением олигоклональной инфильтрации новых репертуаров TCR, мы исследовали частоту CD103 + DC до и после ISIM. Хотя их частота вернулась к исходному уровню после ISIM, вероятно, из-за перемещения находящихся в опухоли DC CD103 + в TdLN (рис.1d, e), второй цикл введения Flt3L восстановил CD103 + DC в опухоли (дополнительный рис. 19b, c), что привело к значительному увеличению TIL CD8 + , уменьшению клеток CD11b + и увеличению CD8 Соотношение клеток + / CD11b + после второй обработки ISIM (дополнительный рис. 19d).

Чтобы оценить изменения репертуаров TCR во время серийного ISIM, у мышей, получавших только PBS (PBS → PBS), ISIM, а затем PBS (ISIM → PBS) или дважды ISIM (ISIM → ISIM), брали продольные биопсии опухоли через Анализ секвенирования TCRβ.Сходство внутриопухолевых репертуаров TCR сравнивали между образцами от одних и тех же мышей с помощью индекса перекрытия Morisita TCR 52 и платформы ImmunoMap, которая позволяет анализировать сходство последовательностей различных областей CDR3 53 . Опухоли, обработанные PBS (PBS → PBS), содержали аналогичные репертуары TCR с высоким индексом перекрытия TCR на протяжении всего курса; однако опухоли, обработанные ISIM, были обогащены новыми клонотипами, характеризующимися более высокой частотой полученных / потерянных клонов и более низким индексом перекрытия TCR между первой (d33) и второй (d45) биопсией, что свидетельствует о клональной экспансии новых клонов Т-клеток ( d33 против d45 на рис.10b, дополнительный рисунок 20 и дополнительные таблицы 1 и 2). Важно отметить, что вторая обработка ISIM (ISIM → ISIM) дополнительно изменила внутриопухолевый репертуар TCR, в то время как одиночные обработанные ISIM (ISIM → PBS) опухоли поддерживали высокий индекс перекрытия TCR с аналогичными клонально расширяющимися Т-клетками между вторым (d45) и третьим (d55) биопсии (d45 против d55 на фиг. 10b, дополнительном рисунке 20 и дополнительной таблице 2), предполагая непрерывную клональную замену TIL серийным ISIM.

Последовательный ISIM в сочетании с блокадой PD-L1 устраняет опухоли, плохо инфильтрованные Т-клетками, и устанавливает системную иммунологическую память, специфичную для опухоли.

Наконец, мы исследовали, может ли серийный ISIM преодолеть приобретенную устойчивость к терапии анти-PD-L1.Эффективные регрессии опухоли наблюдались после каждого цикла ISIM в сочетании с терапией анти-PD-L1, что приводило к устойчивым полным ответам у всех обработанных мышей после четвертого цикла (фиг. 10c). Эти выжившие мыши отторгали те же самые опухоли AT-3, повторно зараженные в контралатеральной жировой подушке молочной железы, но не несвязанные опухоли B16, инокулированные на спине, что указывает на развитие опухолеспецифической системной иммунологической памяти (фиг. 10d). В соответствии с этим, мы также наблюдали лечебный потенциал серийной терапии ISIM и анти-PD-L1 (дополнительный рис.21a) и формирование системной иммунологической памяти против меланомы B16 (дополнительный рис. 21b). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что индукция и активация cDC1 in situ могут изменять тип, плотность и репертуар внутриопухолевых Т-клеток, преобразовывать плохо инфильтрованные Т-клетками опухоли и преодолевать первичную и приобретенную резистентность к терапии анти-PD-L1.

Селективное ингибирование активации TGFβ1 преодолевает первичную резистентность к терапии блокадой контрольных точек за счет изменения иммунного ландшафта опухоли

Эта изоформа как раз подходит

Иммунотерапия рака, включая блокаду иммунных контрольных точек, в последние годы стала все более заметной.К сожалению, только небольшая часть опухолей поддается лечению. Предыдущие исследования показали, что ингибирование трансформирующего фактора роста-β (TGFβ) может помочь преодолеть устойчивость к блокаде иммунных контрольных точек, но оказалось, что оно слишком токсично для клинического использования. Мартин и др. разработал более специфический ингибитор, нацеленный только на одну изоформу TGFβ. Авторы показали, что эта изоформа, TGFβ1, является наиболее подходящей для нацеливания на опухоли, а затем продемонстрировали эффективность и безопасность своего ингибитора с блокадой иммунных контрольных точек на нескольких моделях рака на мышах.

Abstract

Несмотря на прорыв, достигнутый с помощью терапии блокадой контрольных точек рака (CBT), многие пациенты не реагируют на анти-запрограммированную клеточную смерть-1 (PD-1) из-за первичной или приобретенной резистентности. Профилирование опухолей человека и доклинические исследования на моделях опухолей недавно выявили активность передачи сигнала трансформирующего фактора роста β (TGFβ) в качестве потенциальной точки вмешательства для преодоления первичной устойчивости к КПТ. Однако разработке методов лечения, направленных на передачу сигналов TGFβ, препятствует ограничивающая дозу кардиотоксичность, возможно, из-за неселективного ингибирования множества изоформ TGFβ.Анализ данных экспрессии мРНК из Атласа ракового генома показал, что TGFΒ1 является наиболее распространенной изоформой TGFβ, экспрессируемой во многих типах опухолей человека, что позволяет предположить, что TGFβ1 может быть ключевым фактором первичной устойчивости к CBT. Чтобы проверить, достаточно ли селективного ингибирования TGFβ1 для преодоления устойчивости к CBT, мы создали высокоаффинное полностью человеческое антитело SRK-181, которое избирательно связывается с латентным TGFβ1 и ингибирует его активацию. Совместное введение SRK-181-mIgG1 и антитела против PD-1 мышам с сингенными опухолями, резистентными к лечению анти-PD-1, вызывало выраженные противоопухолевые ответы и улучшение выживаемости.Специфическое нацеливание на TGFβ1 было также эффективным в опухолях, экспрессирующих более одной изоформы TGFβ. Комбинированная обработка SRK-181-mIgG1 и анти-PD-1 привела к увеличению внутриопухолевых CD8 + Т-клеток и снижению иммуносупрессивных миелоидных клеток. Сердечная вальвулопатия не наблюдалась в 4-недельном токсикологическом исследовании на крысах с SRK-181, предполагая, что избирательное блокирование активации TGFβ1 может избежать ограничивающей дозу токсичности, ранее наблюдавшейся с пан-ингибиторами TGFβ. Эти результаты обосновывают необходимость изучения избирательного ингибирования TGFβ1 для преодоления первичной устойчивости к CBT.

ВВЕДЕНИЕ

Достижения в области иммунотерапии изменили ландшафт эффективного лечения растущего числа больных раком. Наиболее известными являются методы лечения блокадой контрольных точек (КПТ), которые теперь стали частью стандартных схем лечения растущего числа раковых заболеваний. Хотя глубокие и стойкие ответы КПТ наблюдаются при растущем числе типов рака, значительная часть опухолей остается невосприимчивой к этим методам лечения. Это верно даже в начале лечения, предполагая, что дополнительные механизмы могут препятствовать нацеливанию иммунной системы многих пациентов и уничтожению опухолевых клеток ( 1 ).Подходы, направленные на распространение эффективности лечения на большее количество пациентов, включают комбинирование КПТ с другими агентами, которые либо воздействуют на тот же тип опухоли, либо модулируют, казалось бы, соответствующие компоненты иммунной системы. К сожалению, многие из этих эмпирических комбинаций не имеют четкого, клинически полученного, механистического обоснования, и на сегодняшний день большинство из них не продемонстрировали значимого клинического преимущества по сравнению с одной только КПТ ( 2 4 ). Поэтому более глубокое понимание основных механизмов, определяющих первичную резистентность к КПТ, становится все более важным направлением в иммунотерапии рака.Среди этих усилий — ретроспективный анализ опухолей пациентов и данные клинических исследований, из которых следует, что активация пути трансформирующего фактора роста — β (TGFβ) является критическим медиатором первичной резистентности к КПТ. Транскрипционное профилирование биопсий меланомы перед лечением у пациентов, которые не реагируют на КПТ против запрограммированной клеточной смерти-1 (PD-1), выявило обогащение путей, связанных с TGFβ ( 5 ). Совсем недавно аналогичный анализ метастатического уротелиального рака также выявил корреляцию между транскрипционными сигнатурами, связанными с TGFβ, и отсутствием реакции на блокаду лиганда 1 запрограммированной смерти (PD-L1), особенно в опухолях, где Т-клетки CD8, по-видимому, исключены из опухоли. запись ( 6 ).Эти наблюдения на клинических образцах дополнительно подкрепляются исследованиями на моделях сингенных опухолей мышей. В модели рака молочной железы EMT-6, которая плохо реагирует на лечение анти-PD-L1, сочетание ингибирования контрольной точки с ингибированием TGFβ привело к значительному увеличению частоты полных ответов ( 6 ). Эта противоопухолевая активность комбинированной терапии коррелировала с фенотипическими изменениями в связанных с раком фибробластах (CAF) и инфильтрацией активированных Т-лимфоцитов CD8 в опухоли.Сочетание блокады PD-L1 с низкомолекулярным ингибитором рецептора TGFβ типа I ALK5 на модели колоректального рака у мышей также дало аналогичные результаты ( 7 ). В совокупности клинически полученные корреляционные доказательства и результаты доклинической проверки указывают на ингибирование пути TGFβ в опухолях, резистентных к КПТ, как на многообещающий подход к увеличению числа клинических ответов на КПТ.

Млекопитающие экспрессируют три фактора роста TGFβ, TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3, каждый из которых кодируется отдельным геном и все передают сигнал через один и тот же рецепторный комплекс TGFβ.Все три изоформы экспрессируются в виде неактивных белковых комплексов, в которых продомен TGFβ, также называемый латентно-ассоциированным пептидом (LAP), обволакивает его фактор роста, удерживая его в латентном, несигнальном состоянии ( 8 ). Этот латентный комплекс TGFβ, также называемый малым латентным комплексом (SLC), коэкспрессируется и дисульфидно связывается с одним из нескольких TGFβ-связывающих белков с образованием больших латентных комплексов (LLC). Было идентифицировано несколько LLC-презентирующих белков: латентный TGFβ-связывающий белок-1 (LTBP1) и LTBP3 привязывают ассоциированный латентный TGFβ-белок к внеклеточному матриксу, тогда как трансмембранные белки с преобладанием повторов гликопротеина A (GARP) и белок, содержащий повторы с высоким содержанием лейцина. 33 (LRRC33) представляют TGFβ на поверхности регуляторных T (T reg ) клеток или макрофагов соответственно ( 9 12 ).In vivo латентный TGFβ1 и латентный TGFβ3 активируются подмножеством интегринов αV, связывая консенсусную последовательность RGD (Arg-Gly-Asp) на LAP и запуская конформационное изменение, которое высвобождает фактор роста ( 13 , 14 ) . TGFβ1 может также высвобождаться посредством протеолитического расщепления LAP, хотя биологическая значимость этого механизма активации менее ясна ( 15 , 16 ). Механизм латентной активации TGFβ2 неизвестен, поскольку в нем отсутствует консенсусный мотив RGD.

Несмотря на очевидную роль в биологии, связанной с заболеванием, терапевтическое нацеливание на путь TGFβ оказалось сложной задачей. Опосредованное низкими молекулами ингибирование киназы рецептора TGFβ типа I ALK5 или блокада антителом всех трех изоформ TGFβ привело к тяжелым сердечным вальвулопатиям у мышей, крыс и собак ( 17 19 ), что позволяет предположить, что широкое ингибирование передачи сигналов осуществляется одним или несколько изоформ TGFβ будут ограничивать клиническую применимость таких агентов. В свете наблюдаемой доклинической токсичности, ограничивающей дозу, приемлемые клинические режимы дозирования для этих «пан-TGFβ» ингибиторов на сегодняшний день оказались неэффективными ( 20 22 ).Как следствие, на сегодняшний день не одобрена терапия, направленная на путь TGFβ, что препятствует лечению патогенеза заболевания, управляемого TGFβ ( 23 ).

Одним из возможных подходов к терапевтическому нацеливанию активности TGFβ, избегая токсичности на мишени, является специфическое ингибирование изоформы TGFβ, которая может быть ключевым фактором процессов, связанных с заболеванием. Несмотря на использование общего набора рецепторов, мыши с нокаутом по TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3 обладают неперекрывающимися фенотипами, что свидетельствует о различных биологических функциях ( 24 26 ).Генетические данные на мышах и людях предполагают, что сердечные фенотипы, связанные с ингибированием пан-TGFβ, могут быть связаны с потерей активности TGFβ2 и, возможно, TGFβ3. Хотя мыши с нокаутом Tgfb2 демонстрируют ряд фенотипов развития, включая врожденные пороки сердца ( 25 ), мыши с гаплонедостаточностью Tgfb2 развиваются нормально, но демонстрируют расширение кольца аорты примерно к 8 месяцам ( 27 ). У людей мутации с потерей функции в гене TGFB2 были идентифицированы у пациентов с расслоением аневризмы грудной аорты (TAAD) при синдромах Марфана и Лойса-Дитца ( 27 , 28 ) с несиндромным TAAD ( 29 ), а также с поражением митрального клапана ( 29 , 30 ).Прогнозируемые мутации частичной потери функции в TGFB3 также были связаны с дефектами аорты у пациентов с Loeys-Dietz ( 31 ), а также с сердечными аритмиями ( 32 ). Однако неясно, присутствуют ли подобные сердечные фенотипы у мышей с нокаутом, поскольку полная делеция гена Tgfb3 вызывает перинатальную летальность из-за тяжелой волчьей пасти и черепно-лицевых дефектов ( 24 ). Вместе эти данные указывают на потенциально важную гомеостатическую роль TGFβ2 и TGFβ3 в сердечной функции, предполагая, что специфическое ингибирование изоформы TGFβ1 может быть стратегией, позволяющей избежать кардиотоксичности, связанной с подходами пан-TGFβ.

Здесь мы обнаруживаем доказательства того, что TGFβ1 является вероятным драйвером изменений в микросреде опухоли и, в частности, в иммунном контексте опухоли, которые делают такие опухоли устойчивыми к CBT. Мы описываем SRK-181, мощный и высокоселективный ингибитор латентной активации TGFβ1, и демонстрируем, что специфическое ингибирование изоформы TGFβ1 достаточно для преодоления первичной устойчивости к анти-PD-1 в моделях сингенных опухолей мышей, которые точно повторяют особенности первичной устойчивость к КПТ, обнаруженная при раковых заболеваниях человека.Кроме того, в токсикологических исследованиях на крысах, ранее показавших, что они выявляют вышеупомянутую ограничивающую дозу токсичность, наблюдаемую при ингибировании широкого пути, мы демонстрируем улучшенный профиль безопасности для TGFβ1-специфического ингибирования по сравнению с терапиями, направленными на пан-TGFβ или ALK5. Вместе эти данные дают веское обоснование терапевтического использования селективного ингибирования TGFβ1, и в частности SRK-181, для расширения и усиления клинических ответов на блокаду контрольных точек при иммунотерапии пациентов с раком.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия гена TGFB1 преобладает во многих типах опухолей человека

Предыдущие анализы выявили, что передача сигналов TGFβ является важным фактором первичной устойчивости к КПТ в опухолях человека ( 5 7 ). При уротелиальном раке TGFΒ1 , по-видимому, является одним из наиболее сильно коррелированных генов пути TGFβ, связанных с отсутствием ответа на атезолизумаб ( 6 ), что позволяет предположить, что эта изоформа может быть особенно важной в управлении иммуномодулирующей передачей сигналов TGFβ в микроокружении опухоли.Для дальнейшего изучения того, имеет ли это открытие более широкое отношение к раку человека, экспрессию мРНК TGFΒ1 , TGFΒ2 и TGFΒ3 оценивали с использованием данных секвенирования РНК (RNA-seq) из Атласа генома рака (TCGA). Сравнительный анализ выявил TGFΒ1 как наиболее распространенную изоформу, которая экспрессируется при большинстве типов рака человека (рис. 1А). Заметными исключениями были рак груди, мезотелиома и рак простаты, где экспрессия других членов семьи, в частности TGFΒ3 , была, по крайней мере, столь же распространена, как TGFΒ1 .При исследовании на уровне отдельных образцов семи типов опухолей, для которых КПТ в настоящее время одобрены для использования в терапевтических целях, экспрессия мРНК TGFΒ1 оказалась выше и чаще по сравнению с TGFΒ2 и TGFΒ3 , опять же с заметным исключение карциномы груди (рис. S1A). Эти и ранее опубликованные наблюдения при уротелиальном раке ( 6 ) предполагают, что активность пути TGFβ может быть обусловлена ​​активацией TGFβ1 в большинстве опухолей человека.Чтобы установить более прямую связь между экспрессией изоформы и передачей сигналов TGFβ, мы определили, существуют ли корреляции между экспрессией изоформы TGFβ в этих семи типах опухолей и двумя разными сигнатурами генов активации пути TGFβ ( 33 , 34 ). Используя любой набор генов, мРНК TGFΒ1 наиболее последовательно и достоверно коррелировала с активацией пути TGFβ ( P ≤ 10 -6 ; фиг. 1B и фиг. S1B). Чтобы дополнительно подтвердить эту ассоциацию экспрессии TGFβ1, мы оценили взаимосвязь экспрессии изоформы TGFβ с транскрипционной сигнатурой врожденной устойчивости к PD-1 [IPRES ( 5 )].Для этих семи типов опухолей мы обнаружили значительную корреляцию между экспрессией мРНК TGFΒ1 и IPRES ( P ≤ 10 -9 ), тогда как для экспрессии мРНК TGFB2 и TGFB3 корреляции либо отсутствовали, либо были ограничены (Рис . 1С). Это предполагает, что TGFβ1 является наиболее вероятной изоформой, которая будет способствовать первичной устойчивости к CBT в этих микроокружениях опухоли. В совокупности эти наблюдения предполагают, что избирательное ингибирование TGFβ1 может быть достаточным для преодоления управляемой путем TGFβ первичной резистентности CBT в большинстве, если не во всех, типах опухолей.

Рис. 1 Экспрессия изоформы TGFβ1 преобладает в большинстве опухолей человека и коррелирует с транскрипционными сигнатурами активации пути TGFβ.

( A ) Тепловая карта, показывающая процент образцов опухолей пациентов из базы данных TCGA, получивших положительный результат (количество фрагментов на миллион килобаз, FPKM ≥30) для каждой изоформы TGFβ. Типы опухолей стратифицируются на основе аннотации TCGA. ( B ) Корреляционный анализ ( R , коэффициент Пирсона) экспрессии изоформы TGFβ (отсечение FPKM ≥10) и сигнатуры гена активации пути TGFβ из Plasari et al. ( 33 ) для выбранных типов опухолей, определенных TCGA, для которых в настоящее время в качестве терапевтического вмешательства используется терапия CBT; значимость ассоциации определяется двусторонним тестом t . ( C ) Анализ, аналогичный описанному в (B), но с использованием сигнатуры транскрипции IPRES ( 5 ) для того же набора типов опухолей. BLCA, уротелиальная карцинома мочевого пузыря; BRCA, инвазивная карцинома груди; ESCA, карцинома пищевода; LUAD — аденокарцинома легкого; LUSC, плоскоклеточный рак легкого; SKCM, кожная меланома кожи; STAD, аденокарцинома желудка.

Открытие SRK-181: мощный и селективный ингибитор латентной активации TGFβ1

Чтобы проверить гипотезу о том, что ингибирование TGFβ1 может преодолеть первичную резистентность CBT, мы идентифицировали SRK-181, высокоселективный антител, ингибитор активации TGFβ1. Учитывая высокую последовательность и структурное сходство между зрелым фактором роста TGFβ1 и его близкими членами семейства, TGFβ2 и TGFβ3 (таблица S1), мы пришли к выводу, что идентификация селективных высокоаффинных антител, нацеленных на активный фактор роста TGFβ1, вероятно, будет серьезной проблемой. .Однако недавние исследования структуры и механических аспектов латентной активации TGFβ1 интегринами ( 8 , 13 ) предполагают возможность нацеливания на латентные комплексы TGFβ1 для ингибирования высвобождения активного фактора роста. Такой подход может использовать более низкое сходство последовательностей в продоменах TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3, обеспечивая селективность изоформ как в связывании, так и в блокировании активации (таблица S1).

Ключевым моментом в этом подходе является то, что латентный TGFβ1 собирается в связанные с дисульфидом LLCs, которые представляют латентный прокомплекс либо во внеклеточном матриксе, либо на поверхности клетки.Данные TCGA показали, что практически все типы опухолей экспрессируют мРНК, кодирующую все четыре молекулы, представляющие LLC, а именно LTBP1 , LTBP3 , GARP и LRRC33 (рис. S1C), что повышает вероятность того, что несколько TGFβ1 LLC могут присутствовать в микросреде опухоли. Из-за этого мы стремились идентифицировать антитела, которые будут специфически связывать и ингибировать латентную активацию TGFβ1 во всех этих локальных контекстах.

Растворимые мышиные и человеческие формы каждого TGFβ1 LLC были сконструированы, экспрессированы, очищены, охарактеризованы (рис.S2, A и B) и использовали для скрининга библиотеки наивных человеческих антител, представленных на дрожжевых поверхностях. Несложные молекулы, представляющие LLC, также использовали на этапах отрицательного отбора, чтобы гарантировать идентификацию селективных латентных связывающих TGFβ1. На основе его избирательного связывания со всеми LLC TGFβ1 и ингибирования латентной активации TGFβ1, запускаемой интегринами, исходное антитело с умеренным сродством было дополнительно оптимизировано путем перетасовки петли CDRh2 / 2 и мутагенеза CDRh4 с использованием той же платформы антител.В результате этого процесса мы идентифицировали SRK-181, полностью человеческое антитело иммуноглобулина G4 (IgG4) / каппа со стабилизирующей шарнир мутацией S228P для предотвращения обмена Fab-плеча ( 35 ). SRK-181 связывает латентные комплексы TGFβ1 с минимальным связыванием или без связывания с латентными TGFβ2 или латентными комплексами TGFβ3 (рис. 2A). Кроме того, SRK-181 не связывает ни один из трех активных факторов роста TGFβ (рис. S3). Равновесное титрование раствора использовали для подтверждения высокой аффинности связывания SRK-181 со значениями константы диссоциации ( K D ) в низком пикомолярном диапазоне для всех четырех LLC TGFβ1 человека (рис.2Б). Сходные аффинности были определены в комплексах TGFβ1 мыши, крысы и яванского макака.

Фиг. 2 SRK-181 представляет собой изоформ-специфичное анти-латентное антитело против TGFβ1, которое ингибирует активацию TGFβ1.

( A ) SRK-181 был захвачен на биосенсорах против человеческого Fc, и связывание с человеческими LTBP1 LLC с TGFβ1, TGFβ2 или TGFβ3 измеряли с помощью интерферометрии биослоя. Фазу ассоциации измеряли в течение 10 минут, погружая сенсор в 100 нМ раствор антигена, и последующую диссоциацию регистрировали в буфере в течение 10 минут.( B ) Сродство SRK-181 к LLC TGFβ1 разных видов определяли равновесным титрованием. Наилучшие значения K D были рассчитаны в Prism с помощью нелинейного регрессионного анализа данных связывания и указаны как средние ± стандартная ошибка от одного до двух экспериментов, каждый из которых проводился в двух экземплярах; н.о., не определено. ( C ) Клетки LN229 трансфицировали плазмидой, кодирующей человеческий proTGFβ1 или человеческий proTGFβ3 (образование LLC с эндогенным LTBP), или котрансфицировали плазмидами, кодирующими человеческий proTGFβ1 плюс GARP или LRRC33 для образования LLC на поверхности клетки.Активность TGFβ измеряли с помощью репортерных клеток CAGA12. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение из двух независимых экспериментов, каждый из которых был проведен в трех экземплярах. Кривые лучше всего подходят для модели ингибирования доза-ответ. ( D ) Репортерные клетки CAGA12 культивировали в течение примерно 18 часов с TGFβ1 SLC в отсутствие или в присутствии калликреина плазмы человека (KLK). Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение одного эксперимента, проведенного в четырех повторностях, и репрезентативны по крайней мере для трех независимых экспериментов. ( E ) CD4 + Т-эффекторные клетки человека (Teff) и аутологичные регуляторные Т-клетки (T reg ) выделяли из свежевыделенных PBMC человека.Клетки Teff метили с помощью CellTrace Violet, активировали и культивировали в отсутствие или в присутствии клеток T reg и указанных антител (1 или 10 мкг / мл) в условиях активации Т-клеток в течение 5 дней. Деление Teff определяли путем измерения разведения CellTrace Violet с помощью проточной цитометрии. Показаны отдельные точки данных плюс среднее значение из одного эксперимента, проведенного в двух экземплярах, что представляет два независимых эксперимента, проведенных с клетками от двух отдельных доноров. ** P ≤ 0.01; *** P ≤ 0,001; Двусторонний тест ученика t .

Для измерения эффекта SRK-181 на латентную активацию TGFβ1, опосредованную интегрином, мы разработали серию клеточных анализов, позволяющих представить и активировать TGFβ1 в каждом из контекстов LLC. Клетки глиобластомы LN229 человека эндогенно экспрессируют мРНК LTBP1 и LTBP3 (фиг. S4A), которые при трансфекции плазмидой, кодирующей TGFβ1 или TGFβ3, могут депонировать TGFβ LLC во внеклеточный матрикс.Поскольку клетки LN229 не экспрессируют мРНК GARP или LRRC33 (фиг. S4A), анализы LLC, содержащие эти молекулы, были получены путем котрансфекции плазмид, кодирующих одну из этих презентационных молекул, в сочетании с конструкцией экспрессии TGFβ1. Клетки LN229 также экспрессируют интегрины α V β 8 ( 36 ) и, следовательно, могут активировать латентные комплексы TGFβ1 ( 37 , 38 ). Следовательно, как только TGFβ1 LLC откладываются во внеклеточный матрикс или продуцируются на поверхности клетки, они могут активироваться эндогенными интегринами α V β 8 , экспрессируемыми теми же клетками.TGFβ1, высвобождаемый этими интегринами, может затем взаимодействовать со своим родственным рецептором, и эта передача сигналов измеряется путем совместного культивирования с линией репортерных клеток на основе люциферазы. Все LLC TGFβ1 были легко активированы в этих анализах. Мы также отмечаем, что котрансфекция GARP или LRRC33 в клетки LN229, экспрессирующие латентный TGFβ1, привела к значительно более высокому сигналу TGFβ1, подтверждая образование и активацию TGFβ1 LLC на клеточной поверхности, которых, по-видимому, достаточно, чтобы вытеснить эндогенные LTBP для внутриклеточной сборки LLC (рис.S4B).

SRK-181 ингибировал активацию всех LLC TGFβ1 человека в зависимости от концентрации, со значениями средней ингибирующей концентрации (IC 50 ) от 1,15 нМ (от 0,86 до 1,55 нМ с 95% доверительным интервалом) до 1,42 нМ (от 1,08 до 1,89). нМ; рис. 2С). Ингибирование активации мышиного TGFβ1 было аналогично человеческим комплексам в соответствии с наблюдаемым и сходным сродством SRK-181 к человеческим и мышиным комплексам (фиг. S5). В соответствии с отсутствием связывания SRK-181 с LTBP1-TGFβ3 LLC, ингибирование LTBP-TGFβ3 практически отсутствовало, что демонстрирует, что SRK-181 избирательно ингибирует активацию TGFβ1 (рис.2С). SRK-181 также блокировал активацию латентного TGFβ1 калликреином плазмы человека (фиг. 2D), указывая на то, что SRK-181 может предотвращать активацию TGFβ1 посредством множества предполагаемых механизмов активации.

Чтобы оценить опосредованное SRK-181 ингибирование биологически значимого следствия активации TGFβ1, мы исследовали его влияние на супрессивную активность первичных клеток T reg человека. Отсортированные CD4 + CD25 hi CD127 lo T reg клетки повышают экспрессию на поверхности GARP-TGFβ1 LLC при стимуляции Т-клеточного рецептора (рис.S6). Эти активированные клетки T reg подавляли пролиферацию аутологичных эффекторных Т-клеток CD4, тогда как добавление SRK-181 блокировало эту супрессивную активность клеток T reg при таких низких концентрациях, как 1 мкг / мл (фиг. 2E). Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями о том, что клетки T reg используют передачу сигналов TGFβ для подавления активности Т-клеток ( 39 , 40 ).

Сайт связывания SRK-181

Чтобы определить возможные сайты взаимодействия между SRK-181 и латентным TGFβ1, которые могут помочь в дальнейшем понимании его ингибирующего механизма, мы провели масс-спектрометрию с водородно-дейтериевым обменом (H / DX-MS).Мы достигли превосходного пептидного покрытия 89,6% (рис. S7A), выявив три области на SLC TGFβ1, которые были защищены от обмена дейтерия связыванием Fab SRK-181 (рис. 3, A и B, и рис. S7, B-D). . Область 1 находится в продомене TGFβ1, тогда как области 2 и 3 отображаются на фактор роста TGFβ1. Область 1 является частью латентного лассо и, в соответствии с нашим наблюдением, SRK-181 ингибирует опосредованную калликреином активацию латентного TGFβ1, содержит сайты протеолитического расщепления как для плазминных, так и для калликреиновых протеаз ( 8 , 15 ) (рис.3Б). SRK-181 не связывается ни с одним из трех димеров фактора роста TGFβ (рис. S3), подразумевая, что любые потенциальные взаимодействия с сайтами фактора роста зависят от взаимодействий продоменов. Сайты защиты H / DX также предполагают, что SRK-181 блокирует интегрин-зависимую активацию TGFβ1 посредством механизма аллостерического ингибирования, потому что антитело связывается вне «триггерной петли» внутри продомена, который содержит сайт связывания интегрина RGD (фиг. 3A). Мы дополнительно подтвердили это наблюдение экспериментально, показав, что SRK-181 не блокирует латентное взаимодействие TGFβ1 с рекомбинантным эктодоменом интегрина α V β 6 (рис.S8). Этот H / DX-анализ объясняет наблюдаемую селективность SRK-181 в отношении латентного TGFβ1 по сравнению с латентным TGFβ2 и латентным TGFβ3 комплексами, поскольку выравнивание последовательностей предполагаемых эпитопных областей 1-3 выявило существенное расхождение последовательностей между тремя изоформами TGFβ (фиг. 3B).

Рис. 3 Связывание SRK-181 защищает три области на латентном TGFβ1 от обмена водород / дейтерий.

( A ) Область 1 (красный), область 2 (оранжевый) и область 3 (желтый) на латентном TGFβ1, которые защищены от водородно-дейтериевого обмена (H / DX) при связывании SRK-181 Fab. на модельную структуру гомодимера SLC человеческого TGFβ1 в поверхностном представлении.Продомен TGFβ1 показан синим, фактор роста TGFβ1 показан зеленым, а сайт связывания интегрина RGD в продомене выделен пурпурным цветом для ориентации. Расположение H / DX-защищенных областей согласуется со связыванием SRK-181 с латентной лассо-областью латентного TGFβ1. ( B ) Аминокислотные последовательности трех H / DX-защищенных областей. Область 1 находится в продомене TGFβ1, а области 2 и 3 относятся к фактору роста TGFβ1. В области 1 выделены протеолитические сайты как для плазмина, так и для калликреина в продомене.Также показаны последовательности TGFβ2 и TGFβ3, соответствующие трем H / DX-защищенным областям на TGFβ1. Точки (•) представляют разнообразие аминокислотных последовательностей трех изоформ TGFβ.

Эффекты комбинированного лечения SRK-181 с анти-PD-1 на рост опухолей в опухолях, устойчивых к CBT

SRK-181 позволяет напрямую оценить гипотезу о том, что селективное ингибирование TGFβ1 достаточно для преодоления устойчивости опухоли к CBT. Для доклинических испытаний мы стремились идентифицировать мышиные сингенные модели опухолей, которые воспроизводят ключевые особенности опухолей человека, проявляющих первичную устойчивость к КПТ, включая (i) ограниченный или нулевой ответ на лечение монотерапией анти-PD- (L) 1 в дозах, которые эффективен в других моделях сингенных опухолей, (ii) доказательства иммунного исключения при недостатке инфильтрирующих CD3 + Т-клеток, (iii) доказательства активной передачи сигналов TGFβ и (iv) доказательства экспрессии изоформы TGFβ1.

Используя данные ответа опухоли против PD-1 от одного агента и общедоступные наборы данных RNA-seq из цельной РНК, полученной из опухоли, мы выбрали три модели опухоли, отвечающие этим критериям, для проверки гипотезы TGFβ1: модель рака мочевого пузыря MBT-2 ( MBT-2), модель меланомы Cloudman S91 (S91) и модель рака молочной железы EMT-6 (EMT-6). В каждой модели анализ данных РНК-seq для всей опухоли выявил экспрессию TGFβ-чувствительных генов, что свидетельствует об активации пути TGFβ и низкой экспрессии гена эффекторных Т-клеток по сравнению с маркерами миелоидных клеток, что соответствует фенотипу, исключенному из иммунной системы (рис.S9A). Иммуноферментный анализ также показал, что белок TGFβ1 является наиболее экспрессируемым членом семейства во всех трех моделях опухолей (рис. S9B). В то время как опухоли MBT-2 и S91 практически не содержали определяемых факторов роста TGFβ2 и TGFβ3, опухоли EMT-6 экспрессировали изоформу TGFβ3, что согласуется с профилированием RNA-seq и опубликованными данными (рис. S9A) ( 6 ). Предыдущие исследования модели опухоли EMT-6 и наши первоначальные исследования моделей MBT-2 и S91 подтвердили их устойчивость к лечению анти-PD- (L) 1 (рис.S9C) ( 6 ). Кроме того, передача сигналов TGFβ, по-видимому, участвует в обеспечении устойчивости к блокаде контрольных точек в моделях MBT-2 и S91, поскольку комбинация антитела 1D11 к фактору роста pan-TGFβ с анти-PD-1 приводила к задержке роста опухоли или, в некоторых случаях, регрессия опухоли по сравнению с отсутствием ответа на лечение только анти-PD-1 (рис. S9C).

Затем мы попытались оценить, может ли SRK-181 сделать эти опухолевые модели чувствительными к лечению анти-PD-1. Чтобы минимизировать иммуногенность SRK-181 в моделях сингенных опухолей мышей, мы продуцировали SRK-181 в виде химерного антитела с человеческими V-доменами SRK-181, слитыми с константными доменами мышиного IgG1 / каппа.Эта химера, названная SRK-181-mIgG1, имела ингибирующую активность, аналогичную полностью человеческой SRK-181 (фиг. S9D). Во-первых, мы исследовали роль TGFβ1 в высокоагрессивной модели опухоли MBT-2 (рис. 4A). Как наблюдалось в наших первоначальных исследованиях, животные с опухолью MBT-2 не отвечали на лечение только анти-PD-1 (клон RMP1-14) или SRK-181-mIgG1 (рис. 4B). Однако комбинация анти-PD-1 и SRK-181-mIgG1 привела к снижению опухолевой нагрузки у нескольких мышей, включая 21% (3 мг / кг в неделю) и 36% (10 мг / кг в неделю) полных. ответы (определение см. в материалах и методах), а также значительный выигрыш в выживаемости на протяжении всего исследования ( P <0.001; Рис.4, Б и В). Всего 4 из 14 животных ответили на анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1 (3 мг / кг в неделю), а 8 из 14 ответили на анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1 (10 мг / кг в неделю). кг в неделю) по сравнению с 0 из 13, получавших только анти-PD-1.

Рис. 4. Противоопухолевые эффекты и выживаемость комбинации SRK-181-mIgG1 с анти-PD-1 в сингенных опухолях мышей, устойчивых к блокаде контрольных точек.

( A ) Схема эксперимента для исследования MBT-2. Клетки MBT-2 были имплантированы подкожно, и дозирование было начато 14 дней спустя, когда средний объем опухоли в группе достиг 56-57 мм 3 .Исследование закончилось на 32 день. ( B ) Рост опухоли (мм 3 ) с течением времени во время лечения установленных подкожных опухолей MBT-2. SRK-181-mIgG1 или его изотипический контроль вводили один раз в неделю в дозе 10 мг / кг, за исключением случаев, когда это указано. Анти-PD-1 или его контрольное антитело вводили дважды в неделю по 10 мг / кг. Язвы опухоли являются общей чертой этой модели, и животные с выраженными изъязвлениями были умерщвлены по усмотрению ветеринара и исключены из последующих анализов выживаемости, но представлены здесь пунктирными линиями и дополнительно описаны в таблице S2.Красная пунктирная линия проходит через 1200 мм 3 , конечную точку исследования, определенную IACUC. Синяя пунктирная линия проходит через 300 мм 3 или 25% объема конечной точки, определяя респондентов, которые указаны как доля оцениваемых животных в каждой группе. Данные являются репрезентативными для двух независимых исследований. ( C ) Графики выживания Каплана-Мейера из (B). *** P <0,001 лог-ранговый тест по сравнению с анти-PD-1. ( D ) Экспериментальный план для исследования Cloudman S91. Опухолевые клетки Cloudman S91 были имплантированы, и дозирование было начато через 16 дней, когда средний объем опухоли по группе достиг от 126 до 132 мм 3 .Дозирование продолжалось 72 дня. ( E ) Рост опухоли (мм 3 ) с течением времени во время лечения установленных подкожных опухолей Cloudman S91. SRK-181-mIgG1 или его изотипический контроль вводили один раз в неделю в дозе 30 мг / кг, за исключением случаев, когда это указано. Анти-PD-1 или его контрольное антитело вводили дважды в неделю по 10 мг / кг. Красная пунктирная линия соответствует 2000 мм 3 , конечная точка исследования, определенная IACUC. Синяя пунктирная линия соответствует 25% конечному объему опухоли (500 мм 3 ), определяя респондентов, обозначенных как доля оцениваемых животных в каждой группе.Переломы конечностей являются обычным явлением в этой модели и считаются не связанными с лечением. Животные со сломанными конечностями были умерщвлены по усмотрению ветеринара и не были включены в последующий анализ выживаемости, а обозначены здесь пунктирными линиями и подробно описаны в таблице S2. Данные являются репрезентативными для двух независимых исследований. ( F ) Графики выживания Каплана-Мейера из (E). ** P <0,01; *** P <0,001 лог-ранговый тест по сравнению с анти-PD-1. ( G ) Схема эксперимента для исследования EMT-6.Клетки ЕМТ-6 были имплантированы, и дозирование было начато через 3 дня, когда средний объем опухоли в группе достигло 39–41 мм 3 , и продолжалось на протяжении всего исследования, которое закончилось на 56 день. ( H ) Рост опухоли. (мм 3 ) во время лечения установленных подкожных опухолей EMT-6. SRK-181-mIgG1 или его изотипический контроль вводили один раз в неделю в дозе 10 мг / кг. Анти-PD-1 или его контрольное антитело вводили дважды в неделю по 10 мг / кг. Пан-TGFβ-антитело 1D11 вводили дважды в неделю в дозе 5 мг / кг.Красная пунктирная линия соответствует 2000 мм 3 , конечная точка исследования, определенная IACUC. Синяя пунктирная линия соответствует 25% конечного объема опухоли (500 мм 3 ), определяя респондентов, которые указаны как доля оцениваемых животных в каждой группе. Данные являются репрезентативными для двух независимых исследований. ( I ) Графики выживания Каплана-Мейера из (H). ** P <0,01; логранговый тест по сравнению с анти-PD-1.

Для дальнейшей оценки степени и продолжительности противоопухолевых ответов, наблюдаемых в группах комбинированного исследования, лечение выживших животных было прекращено на 32 день исследования и животных оценивали на предмет возможного повторного роста опухоли.Из 12 мышей, которые ответили на анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1 в конце периода дозирования, 10 мышей остались без опухолей через 7 недель после прекращения лечения, что позволяет предположить, что ответ на комбинированное лечение был устойчивым и вероятным. полный. Кроме того, чтобы оценить, развилась ли у этих мышей прочная иммунная память, мы затем повторно имплантировали клетки MBT-2 подкожно в бок, противоположный исходной имплантации, и наблюдали за последующим ростом опухоли. Мы не наблюдали заметного роста опухоли ни у одной из этих мышей, тогда как у всех мышей в контрольной, сопоставимой по возрасту группе, не получавшей опухоли, в течение 3 недель после имплантации развились измеримые опухоли (рис.S10A). Эти результаты показывают, что мыши, классифицированные как выжившие без опухолей, по-видимому, обладают устойчивой противоопухолевой иммунологической памятью.

Чтобы определить, может ли комбинированное лечение анти-PD-1 с блокадой TGFβ1 быть эффективным в других моделях опухолей, мы затем аналогичным образом оценили лечение одним агентом и комбинированное лечение на модели меланомы Cloudman S91 (рис. 4, D — F). Как и в случае с моделью MBT-2, комбинированное лечение анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1 приводило к выраженным противоопухолевым эффектам, при этом до 75% мышей демонстрировали четкие ответы, которые приводили к значительному увеличению выживаемости при всех уровнях доз ( Р <0.01). Пять респондеров из разных групп комбинации анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1 в исследовании Cloudman S91 действительно сохранили небольшую, но стабильную остаточную массу в месте имплантации в течение оставшегося периода лечения. Хотя мы рассмотрели оценку повторного заражения опухолью в этой модели, частота взятия опухолевых клеток Cloudman S91 после имплантации низкая, что ограничивает возможность последующего анализа этого типа. По этой причине мы могли оценить устойчивость ответов только после прекращения комбинированного лечения у мышей с полным или почти полным ответом.Через шесть недель после прекращения лечения у мышей без опухоли, поддающейся измерению, на момент прекращения опухоли не было. Те, у кого были измеримые опухоли на момент прекращения лечения, имели смешанные ответы: многие из них исчезли, некоторые остались небольшими, но пальпируемыми, тогда как другие, особенно ограниченные группами с наименьшими дозами для SRK-181-mIgG1, начали расти примерно через 20 дней после прекращения лечения (рис. . S10B). Эти данные показывают, что некоторые остаточные опухоли сохраняют способность ускользать или подавлять иммунный ответ хозяина после отмены комбинированного лечения, что позволяет предположить, что лечение может потребоваться до тех пор, пока не будет достигнуто полное исчезновение опухоли.

В отличие от опухолей MBT-2 и Cloudman S91, в которых TGFβ1 является преимущественно экспрессируемой изоформой, модель карциномы молочной железы EMT-6 экспрессирует сходные количества мРНК Tgfb1 и Tgfb3 и примерно в пять раз меньше белка TGFβ3, чем изоформа TGFβ1 (рис. S9, A и B). Чтобы оценить, достаточно ли избирательного ингибирования активации TGFβ1 для преодоления устойчивости к анти-PD-1 при наличии нескольких изоформ TGFβ, мы провели исследования комбинированного лечения на этой модели опухоли (рис.4, G — I). Мы наблюдали полные ответы у 50% мышей с опухолью EMT-6, получавших комбинацию анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1, а также значительное улучшение выживаемости по сравнению с анти-PD-1 или SRK-181- Лечение одним агентом mIgG1 ( P <0,01; рис. 4, H и I). Полные респонденты оставались свободными от опухолей через 6 недель после прекращения лечения, что снова демонстрирует устойчивость ответа (рис. S10C). Эти результаты согласуются с ранее опубликованными наблюдениями на этой модели опухоли с использованием комбинации анти-PD-L1 с пан-TGFβ-антителом ( 6 ).В совокупности наши наблюдения противоопухолевых ответов в этих трех моделях сингенных опухолей предполагают, что локальная активность изоформы TGFβ1 в микроокружении опухоли достаточна для управления иммуносупрессивными эффектами, которые вызывают первичную резистентность к лечению анти-PD-1.

Блокада латентной активации TGFβ1 в сочетании с анти-PD-1 преодолевает иммунное исключение

Для более тщательного выяснения механизмов, с помощью которых передача сигнала TGFβ1 управляет иммунным исключением и предотвращает ответы на лечение анти-PD-1, мы исследовали изменения в иммунном иммунитете опухоли. контекст после комбинированного лечения анти-PD-1 и SRK-181-mIgG1 по сравнению с контролем и лечением одним агентом.Опухоли MBT-2 собирали у мышей через 10 дней после начала лечения и оценивали на предмет изменений в выбранных маркерах иммунных клеток. Хотя общий процент иммунного компартмента CD45 + не изменился при лечении, комбинация анти-PD-1 и SRK-181-mIgG1 вызвала 10-кратное увеличение представительства Т-лимфоцитов CD8 в этом компартменте по сравнению с изотипом. лечение контрольными антителами (в среднем 34 ± 5,6% против 3,5 ± 1,6%, соответственно; фиг. 5А), что соответствует увеличению абсолютного количества Т-лимфоцитов CD8 на миллиграмм опухоли (фиг.S11A). Обработка одним агентом анти-PD-1 или SRK-181-mIgG1 не оказывала эффекта на репрезентативность CD8 Т-клеток. Кроме того, анализ РНК, полученной из этих опухолей, показал увеличение маркеров активации цитотоксических Т-клеток перфорина и гранзима В, что согласуется с увеличением числа клеток CD8 + и указывает на активную эффекторную функцию этих клеток (рис. S11B). Примечательно, что значительное увеличение процента клеток CD4 + FoxP3 + T reg также наблюдалось при комбинированном лечении ( P <0.05). Актуальность этого увеличения неясна, учитывая выраженный противоопухолевый эффект, наблюдаемый при комбинированном лечении. Однако соотношение CD8: T reg клеток не изменилось в ответ на комбинированное лечение (фиг. S11C). Окрашивание внутриклеточных цитокинов подтвердило, что эти клетки T reg экспрессировали низкие количества интерферона-γ (IFN-γ) по сравнению с CD8 T-клетками, тем самым дополнительно подтверждая активированный фенотип последних (рис. S11D). Однако лечение анти-PD-1 и SRK-181-mIgG1 не влияло на размер популяции Т-клеток IFNγ + CD8 (рис.S11D).

Рис. 5 Блокада латентного TGFβ1 в сочетании с анти-PD-1 преодолевает иммунное исключение.

( A ) Проточно-цитометрический анализ популяций иммунных клеток в опухолях MBT-2 на 10 день после начала лечения, от пяти до шести животных на группу. Mϕ, макрофаги; MDSC, клетки-супрессоры миелоидного происхождения; * P <0,05; ** P <0,01, *** P <0,001 Двусторонний тест Стьюдента t против анти-PD-1. ( B ) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание на CD8 в опухолях MBT-2 на 10 день после начала лечения.Шкала 200 мкм. ( C ) Количественная оценка данных, представленных в (B). Площадь сигнала CD8 + на сканирование предметного стекла всей опухоли, n = от 5 до 6 животных на группу. * P <0,05, двусторонний тест Стьюдента t против группы анти-PD-1. ( D ) Типичное 40-кратное увеличение иммунофлуоресцентного окрашивания для CD8 (голубой) и CD31 (зеленый) в опухолях MBT-2 через 10 дней после начала лечения. Масштабные линейки 30 мкм. ( E ) Распределение клеток CD8 + из объектов CD31 + на основе данных, представленных на примере (D), с использованием анализа ближайшего соседа, объединенного средним диаметром объекта CD8 + , равным 12.4 мкм. Расстояние «0» означает касание объекта CD31 + . Данные показывают процентную долю сигнала CD8 + от общего сигнала опухоли CD8 + для пяти-шести опухолей, сканированных на целое предметное стекло на группу.

В дополнение к заметному увеличению популяции цитотоксических Т-лимфоцитов CD8 в опухолях, лечение комбинацией анти – PD-1 / SRK-181-mIgG1 также индуцировало значительное снижение общей представленности клеток CD11b + в опухолях MBT-2 ( P <0,01; рис.5А). Это, по-видимому, является результатом избирательного снижения субпопуляций CD11b + F4 / 80 + CD206 + и CD11b + F4 / 80 Gr1 + , которые соответствуют иммуносупрессивным M2-подобным макрофагам и миелоидным мышцам. производные супрессорные клетки (MDSC) соответственно (фиг. 5A и фиг. S11A). Высокая экспрессия аргиназы 1 и TGFβ1 LAP M2-подобными макрофагами по сравнению с M1-подобными макрофагами дополнительно подтверждает их обозначение как иммуносупрессивные миелоидные клетки (рис.S11E). В совокупности представительство M2-подобных макрофагов и MDSC снизилось в среднем с 47 ± 3,3% и 10,9 ± 2,7% популяции клеток CD45 + у контрольных животных до 14 ± 6,1% и 1,4 ± 0,6% после комбинированного лечения. соответственно (рис. 5А). Субпопуляция M1-подобных макрофагов (CD11b + F4 / 80 + CD206 ), по-видимому, не изменилась при лечении, что указывает на то, что блокада PD-1 / TGFβ1 оказывает избирательное влияние на иммуносупрессивную среду в опухолях, благотворно затрагивая как лимфоидный, так и миелоидный отделы.

Механизм, с помощью которого комбинированное ингибирование PD-1 и TGFβ1 привело к выраженному входу и / или экспансии Т-лимфоцитов CD8 в микроокружение опухоли, неясен. Следовательно, мы дополнительно изучили взаимосвязь между активностью пути TGFβ и иммунным исключением, используя более подробный гистологический анализ. Во-первых, мы подтвердили значительное увеличение окрашивания CD8 во всех опухолях MBT-2, обработанных анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1, что согласуется с данными проточной цитометрии ( P <0.05; Рис.5, Б и В). Подобное увеличение количества CD8 Т-клеток после комбинированного лечения анти – PD-L1 / 1D11 ранее сообщалось в исследованиях с использованием опухолевой модели EMT-6, предполагая, что проникновение и размножение цитотоксических Т-клеток являются общим механизмом комбинированного ответа ( 6 ) . Более тщательное изучение обработанных опухолей MBT-2 показало, что многие из CD8 Т-клеток в группах анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1 были тесно сгруппированы вокруг того, что выглядело как кровеносные сосуды. Определение CD8 / CD31 и количественная оценка цифрового изображения показали, что CD8 Т-клетки обогащены в областях, прилегающих к кровеносным сосудам опухоли CD31 + (рис.5, D и E), предполагая, что сосудистая сеть опухоли может быть путем проникновения Т-клеток. Это было верно независимо от лечения и также наблюдалось в нашем анализе модели EMT-6 (рис. S11F). Предыдущие исследования сообщили о связи между передачей сигналов TGFβ и наличием богатой фибробластами перитуморальной стромы, предполагая, что строма образует барьер для входа Т-клеток в опухоль ( 6 ). Наши предварительные наблюдения предполагают, что дополнительный, зависимый от TGFβ1 сосудистый барьер также может играть заметную роль в предотвращении проникновения CD8 Т-клеток в опухоль.

Специфичность SRK-181 изоформы TGFβ1 приводит к улучшенному профилю доклинической токсичности по сравнению с подавлением пан-TGFβ

Установив, что избирательное ингибирование активации TGFβ1 необходимо и достаточно для преодоления устойчивости к блокаде PD-1 на множественных моделях опухолей, мы Затем исследовали, будет ли обработка SRK-181 уменьшать сердечную токсичность, наблюдаемую при ингибировании пан-TGFβ. Самкам крыс Sprague-Dawley вводили четыре еженедельных внутривенных дозы SRK-181 в дозах 10, 30 или 100 мг / кг и оценивали в полном токсикологическом анализе.В это исследование также были включены высокоаффинные антитела против фактора роста pan-TGFβ и ингибитор киназы ALK5 / TGFβRI, чтобы повторить ранее опубликованные наблюдения связанной с лечением вальвулопатии сердца ( 17 , 18 ).

В соответствии с ранее опубликованными исследованиями, в течение 1 недели у животных, ежедневно получавших низкомолекулярный ингибитор киназы ALK5 / TGFβRI или однократную дозу пан-TGFβ-антитела, развивались сердечные вальвулопатии, характеризующиеся утолщением сердечного клапана из-за кровотечения, эндотелиальной гиперплазией, смешанный воспалительный клеточный инфильтрат и / или гиперплазия стромы (рис.6А). Напротив, сердечно-сосудистые поражения, связанные с исследуемым препаратом, не наблюдались после лечения SRK-181 при любой испытанной дозе (рис. 6B). Кроме того, все животные, получавшие SRK-181, подверглись общей аутопсии, измерению веса органов, оценке клинической патологии и забору тканей для гистопатологической оценки. Полный гистопатологический анализ всех тканей крыс, получавших SRK-181, не выявил какой-либо связанной с лечением гистопатологии, включая отсутствие доказательств иммунной активации в каких-либо тканевых слоях.Таким образом, уровень отсутствия наблюдаемых побочных эффектов (NOAEL) SRK-181 в этом исследовании был недельной дозой (100 мг / кг), самой высокой испытанной дозой (файл данных S1). Эти результаты предполагают, что селективное ингибирование активации TGFβ1 с помощью SRK-181, по-видимому, хорошо переносится и позволяет избежать ключевой ограничивающей дозу токсичности, наблюдаемой при ингибировании пан-TGFβ в дозах, значительно превышающих те, которые требуются для терапевтического эффекта, наблюдаемого в комбинации с CBT.

Рис. 6. Отсутствие сердечно-сосудистых данных у крыс, получавших SRK-181.

( A ) Гистологическое окрашивание гематоксилином и эозином срезов ткани сердца крыс. Левая панель: Контрольная крыса с нормальными сердечными клапанами. Средняя панель: сердечный клапан, показывающий кровоизлияние и воспалительные клетки у крыс, получавших ингибитор ALK5 LY2109761 (300 мг / кг вводили ежедневно). Правая панель: сердечные клапаны, демонстрирующие кровоизлияние и эндотелиальную гиперплазию у крыс, получавших однократную внутривенную дозу пан-TGFβ-антитела (30 мг / кг). ( B ) Сводная информация о частоте и тяжести сердечных поражений, наблюдаемых в различных группах лечения ( n = 5 на группу).Животным вводили четыре еженедельных внутривенных дозы SRK-181 в дни 1, 8, 15 и 22 и умерщвляли на 29 день для гистопатологической оценки. Животным, получавшим пан-TGFβ-ингибиторы, вводили дозу ежедневно (LY2109761) или один раз в день 1 (пан-TGFβ-антитело) и исследовали через 1 неделю воздействия. Контрольная группа получала четыре еженедельные дозы буфера; пероральный желудочный зонд; iv, внутривенно; qwk, еженедельное дозирование; qd, ежедневное дозирование; Ab, антитело.

ОБСУЖДЕНИЕ

Активация пути TGFβ недавно стала потенциальным фактором первичной устойчивости к КПТ ( 5 , 6 ).В этом клиническом сценарии предполагается, что CD8 T-клетки исключены из проникновения в опухоли за счет активации пути TGFβ ( 6 , 41 ), что позволяет предположить, что опухоли кооптируют иммуномодулирующие функции передачи сигналов TGFβ для генерации иммуносупрессивная микросреда. Эти выводы из ретроспективного клинического анализа образцов опухоли и доклинических исследований послужили обоснованием для дальнейшего изучения роли передачи сигналов TGFβ в первичной устойчивости к КПТ.

По результатам наших исследований можно сделать несколько важных выводов.Во-первых, анализ данных по экспрессии генов из TCGA указывает на TGFβ1 как на наиболее распространенную изоформу во многих типах опухолей человека и идентифицирует связь между экспрессией TGFB1 и активностью пути TGFβ, измеренной по множественным сигнатурам генов. Эти корреляционные анализы предполагают, что экспрессия и активация TGFβ1 являются вероятным фактором иммунного исключения, связанного с первичной резистентностью к CBT в опухолях человека.

Во-вторых, идентификация и тестирование высокоселективного ингибитора активации TGFβ1 подтверждают гипотезу о том, что избирательное ингибирование TGFβ1 будет достаточным для преодоления первичной устойчивости к CBT.Нацеливаясь на латентный продомен TGFβ1, SRK-181 достигает исключительной изоформной селективности, ингибируя латентную активацию TGFβ1 во всех известных молекулярных контекстах без связывания с латентным TGFβ2, латентным TGFβ3 или любым из трех активных факторов роста TGFβ. Фармакологическая оценка SRK-181-mIgG1 в моделях сингенных опухолей, которые были отобраны для отражения характеристик первичной устойчивости к КПТ в опухолях человека, показала, что лечение этим антителом делает такие опухоли чувствительными к лечению анти-PD-1.Комбинированное лечение анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1 привело к глубоким и стойким противоопухолевым ответам на моделях уротелиального рака, меланомы и рака груди и способствовало установлению иммунологической памяти в модели повторного вызова опухоли. Хорошо известно, что индукция прочной противоопухолевой памяти Т-клеток является функцией блокады контрольных точек анти-PD- (L) 1 ( 42 , 43 ). Таким образом, наши наблюдения подтверждают, что блокада активации TGFβ1 позволяет установить ожидаемые анти-PD-1 эффекты на противоопухолевую иммунную активность и память.Комбинация анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1 продемонстрировала противоопухолевую активность на модели рака молочной железы ЕМТ-6, в которой TGFβ1 не был единственной изоформой, присутствующей в опухоли. Противоопухолевый ответ, наблюдаемый при лечении комбинацией анти – PD-1 / SRK-181-mIgG1 в модели EMT-6, соответствовал ранее сообщенной противоопухолевой активности комбинации анти – PD-L1 с 1D11, пан-TGFβ-антителом; Также было ясно показано, что эта комбинационная активность зависит от присутствия Т-клеток ( 6 ).Это предполагает, что TGFβ1, вероятно, играет иммуномодулирующую роль в микроокружении опухоли, тогда как другие изоформы могут не иметь отношения к этой биологии. Это наблюдение предполагает, что избирательное ингибирование TGFβ1 может иметь терапевтический потенциал в преодолении первичной устойчивости к CBT в широком спектре рака, независимо от экспрессии других изоформ TGFβ.

Механистический анализ модели рака мочевого пузыря MBT-2 продемонстрировал, что одновременная блокада активности PD-1 и TGFβ1 вызывает глубокое изменение внутриопухолевого иммунного контекста, особенно 10-кратное увеличение Т-клеток CD8.Эти CD8 T-клетки, вероятно, были медиаторами наблюдаемого уничтожения опухолевых клеток, поскольку ключевые цитолитические гены перфорин и гранзим B также активируются в опухолях при комбинированном лечении. Мы отмечаем, что лечение комбинацией анти-PD-1 / SRK-181-mIgG1 индуцировало обогащение клеток T reg , несколько неожиданное открытие, учитывая важность передачи сигналов TGFβ для поддержания периферических клеток T reg ( 44 ). Мы интерпретируем это увеличение как показатель сильного иммунного ответа, поскольку клетки T reg рекрутируются в места воспаления.CD8 Т-клетки приняли активированный фенотип, вызывая сильный противоопухолевый ответ, несмотря на это увеличение числа клеток T reg . Возможное объяснение того, почему это увеличение клеток T reg не нарушает противоопухолевый ответ, может заключаться в том, что клетки T reg не вносят существенного вклада в иммуносупрессивное микроокружение опухоли MBT-2 и что другие популяции супрессивных иммунных клеток, например, миелоидные клетки играют более важную роль. Альтернативно, но не исключают друг друга, поскольку TGFβ1 является ключевым медиатором управляемой клетками иммуносупрессии T reg , лечение SRK-181-mIgG1 может также аннулировать активность клеток T reg , несмотря на увеличение количества клеток T reg .

В модели рака груди EMT-6 Mariathasan et al. обнаружил, что CD8 Т-клетки, по-видимому, накапливаются вдоль коллагенового матрикса и богатого фибробластами слоя на переднем крае опухоли, подразумевая, что этот матрикс способствует исключению Т-клеток ( 6 ). Напротив, мы не всегда обнаруживали плотную фибробластическую область возле переднего края опухолей MBT-2. Однако неожиданным открытием стало гистологическое наблюдение непосредственной близости Т-клеток CD8 + к сосудистой сети опухоли CD31 + .Этот образец обогащения поддерживает гипотезу о том, что сосудистая сеть опухоли может быть ключевым путем проникновения Т-клеток в опухоль. В этой парадигме Т-клетки будут затем мигрировать и расширяться радиально наружу в опухоль после экстравазации из кровеносных сосудов опухоли. Таким образом, в дополнение к слою CAF иммунное исключение также может быть вызвано TGFβ1-чувствительными эндотелиальными клетками сосудов или другими клетками, расположенными поблизости от эндотелия. Также было описано, что ассоциированные с опухолью макрофаги локализуются рядом с сосудистой сетью опухоли ( 45 ) и могут участвовать в создании иммунно-исключенного микроокружения опухоли либо путем активации TGFβ1 для воздействия на эндотелиальные клетки сосудов опухоли, либо путем продуцирования других иммунодепрессивных факторов на уровне или около него. сосудистая сеть.Вероятно, что Т-клетки проникают в опухоль несколькими путями, и лучшее понимание этих механизмов поможет определить дополнительные механизмы резистентности опухоли и потенциальные терапевтические мишени.

Помимо воздействия на цитотоксические Т-клетки в опухолях, комбинированная терапия SRK-181-mIgG1 / анти-PD-1 также благотворно модулировала иммуносупрессивный миелоидный компартмент. Миелоидные клетки CD11b + составляли почти 80% иммунного инфильтрата в необработанных опухолях MBT-2, но их представительство снизилось до менее 40% после комбинированного лечения.Это было вызвано потерей M2-подобных иммуносупрессивных макрофагов и еще более глубоким снижением MDSC, тогда как популяция провоспалительных M1-подобных макрофагов осталась неизменной. Наблюдаемое снижение иммуносупрессивных миелоидных клеток было не только относительно общего иммунного инфильтрата, но также и абсолютным падением количества этих клеток в опухолевой ткани. Механизм, управляющий этим иммуносупрессивным сокращением миелоидных клеток, неясен, как и роль передачи сигналов TGFβ1 в рекрутинге, развитии или поддержании этих клеток в микроокружении опухоли.Известно, что передача сигналов TGFβ поляризует макрофаги в M2-подобный фенотип ( 46 ). Кроме того, данные свидетельствуют о том, что TGFβ частично ответственен за развитие MDSC и приобретение супрессивных функций ( 47 , 48 ). Приток Т-клеток, секретирующих IFN-γ, в сочетании с измененным микроокружением опухоли может способствовать реполяризации и снижению трафика иммуносупрессивных миелоидных клеток. Независимо от основного механизма, уменьшение количества внутриопухолевых иммуносупрессивных миелоидных клеток было бы очень желательным как часть подхода к иммунотерапии опухолей, потому что эта популяция клеток коррелирует с плохим прогнозом и устойчивостью к терапии блокадой контрольных точек у пациентов ( 49 ).Следовательно, терапевтическая стратегия, нацеленная на эти важные иммуносупрессивные типы клеток, может улучшиться при нацеливании на один тип иммунодепрессивных клеток (например, только клетки T reg ) в микроокружении опухоли.

TGFβ1, вероятно, экспрессируется несколькими типами клеток в микроокружении опухоли, включая клетки T reg , супрессивные миелоидные клетки, фибробласты и опухолевые клетки. Каждый из них продуцирует TGFβ1 в разных LLC: активированные клетки T reg экспрессируют GARP LLC на своей поверхности ( 11 , 12 ), супрессивные миелоидные клетки экспрессируют LLC LRRC33 на своей поверхности ( 9 ), а фибробласты, вероятно, экспрессируют и депонировать LTBP LLC в окружающий внеклеточный матрикс ( 10 ).Каждый источник «активируемого» TGFβ1 может играть роль в стимулировании иммунного исключения и подавления иммунитета в опухоли, и относительный вклад каждого может варьироваться в зависимости от типа опухоли. Профилирование мРНК опухолей MBT-2 и EMT-6, использованное в этих исследованиях, показало, что LRRC33 и LTBP1 являются наиболее экспрессируемыми компонентами LLC, тогда как опухоли Cloudman S91, по-видимому, экспрессируют исключительно LRRC33. Кроме того, мы показали здесь, что M2-подобные макрофаги в опухолях MBT-2 экспрессируют TGFβ1 LAP на своей поверхности, скорее всего, как часть LRRC33-TGFβ1 LLC.Прямое подтверждение экспрессии TGFβ1 делает эту популяцию M2-подобных макрофагов потенциально критическим источником активности TGFβ1 в микроокружении опухоли. Экспрессия и активация латентного TGFβ1 на поверхности иммуносупрессивных миелоидных клеток требует образования LLC с трансмембранным белком LRRC33 ( 9 ). SRK-181 напрямую связывается и ингибирует активацию LRRC33-TGFβ1 LLC и, следовательно, может ингибировать активацию латентного TGFβ1, обеспечиваемого иммуносупрессивными миелоидными клетками.Следовательно, избирательное ингибирование специфических LLC [например, GARP-TGFβ1 LLC на клетках T reg ( 40 )] может быть необходимым, но недостаточным для обеспечения такого же глубокого противоопухолевого ответа, который наблюдается с SRK-181-mIgG1 / комбинированное лечение против PD-1.

Третий ключевой вывод, который мы можем сделать из наших исследований, заключается в том, что избирательное ингибирование активности пути, управляемого TGFβ1, приводит к повышению доклинической безопасности по сравнению с широким ингибированием всех изоформ. Плейотропные эффекты, связанные с ингибированием широкого пути TGFβ, препятствовали терапевтической разработке ингибиторов пути TGFβ.Большинство экспериментальных терапевтических средств на сегодняшний день (например, ингибиторы киназы ALK5 / TGFβRI или пан-TGFβ-антитела) лишены селективности по отношению к изоформе TGFβ и, следовательно, в целом блокируют всю передачу сигналов TGFβ, вероятно, способствуя ограничивающей дозу токсичности, наблюдаемой в доклинических и клинических исследованиях ( 17 , 18 , 20 , 50 , 51 ). Генетические данные как от мышей с нокаутом, так и от мутаций с потерей функции у человека предполагают, что эти токсические эффекты, особенно влияние на сосудистую сеть сердца, могут быть связаны с ингибированием TGFβ2 и / или TGFβ3 ( 30 , 52 , 53 ).Здесь мы демонстрируем, что SRK-181 имеет улучшенный профиль безопасности в 4-недельном токсикологическом исследовании повторных доз на крысах, избегая плейотропных эффектов, связанных с ингибированием пан-TGFβ, с NOAEL при самой высокой испытанной дозе, которая намного превышает требуемые дозы. для выявления устойчивых противоопухолевых ответов в сочетании с блокадой PD-1.

Это исследование имеет два важных ограничения. Во-первых, представленные здесь профили эффективности и безопасности SRK-181 были определены на грызунах. Опухоли человека очень сложны и неоднородны.Потребуются клинические испытания на людях для оценки безопасности SRK-181 и эффективности SRK-181 в сочетании с терапией анти-PD- (L) 1 при лечении солидных опухолей, проявляющих первичную резистентность к анти-PD- (L) 1 терапия. Во-вторых, точные типы клеток, отвечающие на передачу сигналов TGFβ1 в опухоли, не определены. Было бы очень интересно изучить связь между передачей сигналов TGFβ1 и внутриопухолевыми иммуносупрессивными миелоидными клетками и лучше понять, как сосудистая сеть опухоли может участвовать в генерации зависимого от передачи сигналов TGFβ иммунного исключения.

Учитывая широко признанную важность активации пути TGFβ в некоторых процессах заболевания, были предприняты различные подходы в попытке более избирательно воздействовать на активацию пути TGFβ, имеющую отношение к заболеванию, и избежать ранее упомянутых плейотропных побочных эффектов ингибирования широкого пути TGFβ. К ним относятся идентификация все более избирательных изоформ антител к фактору роста TGFβ, открытие антитела, которое избирательно нацелено на ассоциированный с клетками GARP-TGFβ LLC T reg , конструирование ловушек лиганда TGFβ, полученных из рецепторов TGFβ, и разработка лекарственных препаратов. которые нацелены на интегрины, активирующие TGFβ ( 40 , 54 59 ).Биопрепараты, напрямую нацеленные на активный фактор роста TGFβ1, включая антитела и ловушки лигандов, должны иметь возможность преодолевать местное и высокоаффинное взаимодействие между фактором роста TGFβ1 и гетеромерным рецепторным комплексом TGFβ ( 55 ), тогда как нацеленные на латентный TGFβ1 комплекс с SRK-181 предотвращает высвобождение фактора роста из продомена. Неконкурентный механизм ингибирования, опосредованного SRK-181, может оказаться полезным для мощной и стойкой блокады пути TGFβ1 in vivo.

В совокупности представленные здесь результаты демонстрируют, что высокоселективное ингибирование активации TGFβ1 преодолевает ключевой механизм первичной резистентности к CBT, который наблюдали в клинических условиях и повторяли на доклинических моделях. Комбинированное лечение с блокадой PD-1 и SRK-181-mIgG1 продемонстрировало выраженные противоопухолевые ответы на моделях сингенных опухолей, которые в остальном были резистентными к лечению антителами против PD (L) -1. Исключительная селективность этого антитела к TGFβ1 позволяет обойти ранее признанную токсичность менее селективных ингибиторов TGFβ, ограничивающую их клиническое применение.Наши результаты, наряду с клиническим наблюдением ассоциации TGFβ с первичной резистентностью к КПТ, предполагают, что лечение SRK-181 может значительно увеличить число пациентов, которым может помочь КПТ, и являются убедительным обоснованием для клинического тестирования этого подхода.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Представленная здесь работа была разработана для характеристики SRK-181, полностью человеческого антитела подтипа человеческого IgG4 / каппа, которое избирательно ингибирует латентную активацию TGFβ1.Сначала мы исследовали аффинность связывания и селективность изоформы TGFβ1 SRK-181 и его ингибирующую активность в анализах с использованием трансфицированных клеточных линий и первичных клеток T reg человека. Для анализов in vitro было проведено не менее трех независимых экспериментов с техническими дубликатами или тремя повторностями, если не указано иное. Сайт связывания SRK-181 с латентным TGFβ1 определяли с помощью H / DX MS. SRK-181 исследовали на трех различных сингенных моделях опухолей мышей, которые повторяют ключевые особенности, обнаруженные в опухолях человека с первичной устойчивостью к CBT, включая отсутствие ответа на анти-PD-1, доказательства иммунного исключения, экспрессию TGFβ1 и активацию пути TGFβ. .Мы исследовали влияние SRK-181-mIgG1 в комбинации с анти-PD-1 на контроль опухоли и выживаемость животных, а также изменения инфильтратов опухолевых иммунных клеток с помощью проточной цитометрии и ИГХ. Соответствующие размеры групп были определены на основе нашего предыдущего опыта работы с моделями и после консультации с руководителем исследования. Животные, умерщвленные из-за некроза опухоли, изъязвлений или плохого состояния здоровья по усмотрению ветеринара, были исключены из анализа выживаемости, но идентифицированы пунктирными кривыми роста на графиках роста опухоли и в таблице S2.Во время исследований исследователи не были ослеплены. Наконец, доклинический профиль безопасности SRK-181 исследовали в 4-недельном токсикологическом исследовании на крысах и сравнили с менее селективными ингибиторами пан-TGFβ.

Сингенные модели мышей

Исследования на мышах проводились в Charles River Discovery Services North Carolina, учреждении, аккредитованном AAALAC (Ассоциация оценки и аккредитации Международной организации по уходу за лабораторными животными), в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных. и руководящие принципы Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC).Для экспериментов на мышах in vivo данные являются репрезентативными для по крайней мере двух независимых исследований с 5-15 животными в группе, как указано. Мышей с установленными опухолями рандомизировали в группы лечения в первый день на основании размера опухоли, так что средний объем опухоли и диапазоны объемов опухоли совпадали по группам. Информация об ответах опухоли на анти-PD-1 в различных моделях сингенных опухолей мышей была получена от Charles River (www.criver.com/products-services/discovery-services/vivo-pharmacology/oncology-pharmacology-models/syngeneic-models).Для модели MBT-2 самок мышей C3H / HeN (Charles River) в возрасте от 8 до 12 недель анестезировали изофлураном для имплантации 5 × 10 5 опухолевых клеток MBT-2 подкожно в бок. Животных распределяли на группы по 15 для исследований эффективности и 10 для механистического исследования, со средними объемами опухолей в группах от 56 до 57 мм. 3 , так что все группы соответствовали средним начальным объемам и диапазонам. Для Cloudman S91 самок мышей DBA / 2 (Charles River) в возрасте от 8 до 12 недель анестезировали изофлураном для имплантации 5 × 10 5 опухолевых клеток Cloudman S91 в 50% матригеле подкожно в бок.Животных распределяли на группы по 12 человек, когда средний объем опухоли в группе достигал 126-132 мм. 3 , так что все группы имели совпадающие начальные средние значения и диапазоны объемов. Для модели EMT-6 самкам мышей BALB / c в возрасте от 8 до 12 недель (Charles River) имплантировали 5 × 10 6 опухолевых клеток EMT-6 подкожно в бок. Животных распределяли на группы по 10 человек со средним начальным объемом от 39 до 41 мм 3 , так что все группы имели совпадающие средние начальные значения объема и диапазон.Всем животным вводили два антитела: либо анти-PD-1, либо контрольный крысиный IgG1 плюс либо SRK-181-mIgG1, либо его контрольное антитело изотипа. Контрольный IgG1 крысы (rIgG1) или анти-PD-1 (RMP1-14; BioXCell) вводили в дозе 10 мг / кг дважды в неделю. SRK-181-mIgG1 или контрольный mIgG1 вводили в указанных дозах один раз в неделю. Когда тестировали несколько доз SRK-181-mIgG1, его изотипический контроль вводили в наивысшей дозе. Пан-TGFβ-антитело 1D11 (BioXCell) вводили в дозе 5 мг / кг дважды в неделю. В механистических исследованиях SRK-181-mIgG1 или его изотипический контроль вводили в дни 1 и 8, а анти-PD-1 или его изотипический контроль вводили в дни 1, 4 и 8.Все антитела вводили внутрибрюшинно в фосфатно-солевом буфере (PBS). Размер опухоли измеряли штангенциркулем дважды в неделю, и животных умерщвляли с помощью удушья CO 2 , когда опухоль достигала 1200 мм 3 (MBT-2) или 2000 мм 3 (Cloudman S91, EMT-6) или после изъязвления. . Объемы опухоли рассчитывали как объем = w2 × l2, где w — ширина опухоли, а l — длина опухоли в миллиметрах. Опухоли, которые достигли объема 25% или менее от конечной точки исследования (300 мм 3 для MBT-2 и 500 мм 3 для Cloudman S91 и EMT-6), были классифицированы как ответы.Полные ответы были классифицированы как опухоль с объемом менее 13,5 мм 3 для трех или более последовательных измерений. В конце исследования у выживших без опухолей опухоли не пальпировались. Животные, умерщвленные из-за некроза опухоли, изъязвлений или плохого состояния здоровья по усмотрению ветеринара, были исключены из последующих анализов выживаемости, но обозначены пунктирными кривыми роста опухоли на фигурах и указаны в таблице S2.

Доклиническое токсикологическое исследование

Токсикологическое исследование на крысах проводилось в лаборатории Covance Laboratories, Гринфилд, штат Индиана, в учреждении, аккредитованном AAALAC, в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных .Самок крыс Sprague-Dawley в возрасте от семи до восьми недель (Charles River Laboratories) помещали в поликарбонатные клетки, содержащие подходящую подстилку и водяные клапаны, в контролируемой среде (от 20 ° до 26 ° C; относительная влажность от 30 до 70%; 12 -часовой световой и 12-часовой темный циклы), и им предлагали сертифицированный корм для грызунов (Envigo) и воду из-под крана ad libitum. Крыс случайным образом распределяли по экспериментальным группам ( n = 5 животных на группу). Исследование включало контрольную группу, обработанную носителем, группы положительного контроля, обработанные либо низкомолекулярным ингибитором ALK5 LY2109761 (MedChem Express, в дозах 200 и 300 мг / кг), либо высокоаффинным пан-TGFβ-антителом 12.7 ( 60 ) (3, 10 или 30 мг / кг) и группы, обработанные SRK-181 в дозах 10, 30 или 100 мг / кг. LY2109761 был составлен на основе 1% (мас. / Об.) Карбоксиметилцеллюлозы, 0,25% (об. / Об.) Полисорбата 80 и 0,05% (об. / Об.) Dow Corning Antifoam 1510-US в очищенной воде. LY2109761 вводили один раз в день через желудочный зонд, а пан-TGFβ-антитело (в PBS pH 7,4) вводили один раз посредством внутривенной инъекции. Животных, получавших контрольный ингибитор пан-TGFβ, умерщвляли на 8-й день. SRK-181 вводили внутривенно 4 недельными дозами (на 1-й, 8-й, 15-й и 22-й дни), животных умерщвляли на 29-й день и собирали сыворотку для подтверждения. экспозиция.Средние сывороточные концентрации SRK-181 на момент завершения исследования достигли 2,3 мг / мл для группы с дозой 100 мг / кг, что эквивалентно концентрациям, которые примерно в 10 000 раз выше, чем значения ингибирующей активности SRK-181 в IC 50 . как определено в клеточных анализах. Общие клинические наблюдения за животными проводились два раза в день, а наблюдения у клетки проводились после введения дозы для оценки острой токсичности. Другие выполненные наблюдения включали оценку потребления пищи и измерение веса тела один раз в неделю.Они также включали клиническую патологию (гематологию, химический анализ сыворотки и коагуляцию) и анатомическую патологию (макроскопическую и микроскопическую). Полный набор тканей был собран при вскрытии для микроскопической оценки. Ткани консервировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обрезали, обрабатывали в обычном порядке и заливали парафином. Парафиновые блоки были микротомированы, а срезы окрашены гематоксилином и эозином (H&E). В частности, сердце обрезали путем продольного деления пополам по плоскости, перпендикулярной плоскости легочной артерии, чтобы обнажить правый атриовентрикулярный, левый атриовентрикулярный и аортальный клапаны.Обе половинки отправлены на встраивание. Каждую половину сердца залили парафином поверхностью разреза вниз. Блоки были разрезаны, чтобы получить по крайней мере три сердечных клапана. Срезы тканей были исследованы с помощью световой микроскопии сертифицированным членом Американского колледжа ветеринарных патологов. Резюме исследования доступно в файле данных S1 (SRK-181 обозначается как 6993-hIgG4), с удаленными названиями дополнительных тестовых статей, не связанных с SRK-181.

Статистический анализ

GraphPad Prism (версии 7 и 8) и R с пакетом анализа вариаций набора генов (GSVA) ​​использовались для статистического анализа.Значения IC 50 были рассчитаны с помощью нелинейного регрессионного анализа (трехпараметрическая подгонка) данных доза-реакция в Prism. K D значения были рассчитаны с помощью нелинейного регрессионного анализа данных равновесного титрования в Prism. Показанные данные являются средними ± стандартное отклонение, если не указано иное. Статистические тесты и значения P , отмеченные звездочками, отмечены для каждой цифры в легенде. Исходные данные представлены в файле данных S2.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

стм.sciencemag.org/cgi/content/full/12/536/eaay8456/DC1

Материалы и методы

Рис. S1. Экспрессия мРНК изоформы TGFβ и активация пути в отдельных опухолях.

Рис. S2. Характеристика рекомбинантных латентных комплексов TGFβ1.

Рис. S3. SRK-181 не связывает активные факторы роста TGFβ.

Рис. S4. Характеристика экспрессии LLC-презентирующих молекул в клетках LN229.

Рис. S5. SRK-181 ингибирует активацию латентного мышиного TGFβ1 LLC.

Рис. S6. Активация периферических клеток T reg человека индуцирует экспрессию GARP и TGFβ1 LAP на их клеточной поверхности.

Рис. S7. Связывание SRK-181 Fab защищает три области на SLC TGFβ1 от обмена водород / дейтерий.

Рис. S8. SRK-181 и интегрин αVβ 6 могут связываться с SLC TGFβ1 одновременно, что свидетельствует об аллостерическом механизме ингибирования.

Рис. S9. Отбор сингенных моделей опухолей мышей, которые воспроизводят профили устойчивых к CBT опухолей человека.

Рис. S10. Индукция длительного контроля опухоли с помощью комбинированного лечения SRK-181-mIgG1 / анти-PD-1 на множественных моделях опухолей.

Рис. S11. Дальнейшая характеристика лечебного эффекта SRK-181 / анти-PD-1 в опухолях MBT-2.

Таблица S1. Процент идентичности аминокислотной последовательности изоформ TGFβ человека.

Таблица S2. Животные были умерщвлены рано по состоянию здоровья или найдены мертвыми.

Таблица S3. Список реагентов для количественной ПЦР.

Файл данных S1. Резюме доклинического токсикологического исследования.

Файл данных S2. Исходные данные.

Каталожные номера ( 62 70 )

ССЫЛКИ И УКАЗАНИЯ

  1. 3
  2. S. Kojima, N. Dohmae, W. Kondo, Антитела, которые распознают передний край в области, контролирующей активацию TGF-бета. Патент США 8,198,412.

  3. Ю. Руике, В. Ту, Т. Курамочи, Х. Шимада, Ю. Сун, М. Канамори. Антитела против TGFbeta1 и способы их применения. Международная заявка на патент PCT / JP2017 / 031690.

  4. 9060 9060 9060
  5. ↵ 903 903
  6. B.Э. Джонс, Дж. Д. Панкук, С. Роулинсон, антитела, связывающие TGF-β. Патент США 7,927,593.

Благодарности: Мы благодарны Charles River Discovery Services за запуск наших сингенных моделей опухолей мышей. Мы благодарим Adimab (Ливан, Нью-Хэмпшир) за их вклад в открытие и разработку антител. Мы благодарим Covance Laboratories за проведение токсикологического исследования на крысах.Мы благодарим С. Дж. Эйлза (основной объект масс-спектрометрии Института прикладных наук о жизни UMass, Вустер, Массачусетс) за помощь в сборе данных H / DX-MS. Мы благодарим Дж. Чанга за ранний вклад в проект и благодарим А. Донована и Н. Махантаппу за критическое рассмотрение рукописи. Финансирование: Это исследование финансировалось Scholar Rock, Inc. Вклад авторов: C.J.M. разработали, контролировали, анализировали и интерпретировали исследования сингенных опухолей у мышей; проанализировали данные экспрессии генов; и провели анализы T reg .A.D. разработал, координировал и контролировал усилия по обнаружению и разработке антител, а также интерпретировал данные. C.L. и C.C. разработаны и выполнены клеточные анализы. А.К. разработал и руководил токсикологическим исследованием на крысах. С.В. координировал усилия в области биоинформатики, анализировал и интерпретировал данные экспрессии генов, а также контролировал усилия по анализу и биоаналитике на основе клеток. K.B.D. спроектировал, выполнил, проанализировал и интерпретировал эксперимент H / DX; очищенные и охарактеризованные рекомбинантные белки; и провели биохимические соревновательные эксперименты.C.T.B. разработали методы ИГХ, выполнили ИГХ-анализ тканей мышей и проанализировали данные. A.N., F.T.D., F.C.S. и C.B. экспрессировали, очищали и характеризовали рекомбинантные белки. В ВИДЕ. и N.D. проанализировали опухоли мышей и интерпретировали результаты. J.W.J. провели эксперименты по интерферометрии биослоя и интерпретировали результаты. S.L. разработали протоколы равновесного титрования, провели эксперименты и проанализировали данные. R.R.F. разработаны методы фармакокинетики и проанализированы образцы сыворотки крови крыс. П.Р. внес свой вклад в биоинформатический анализ и интерпретацию экспрессии опухолевых генов.A.D.C. руководил исследованиями в области белковой науки, разработал стратегии экспрессии и очистки белков, экспрессировал и очищал белки и интерпретировал данные. А.Б. и G.J.C. руководил исследованием, давал стратегическое руководство, а также обсуждал и интерпретировал данные. Т.С. инициировал исследование, разработал антигены, руководил общим проектом, а также обсудил и интерпретировал данные. К.Дж.М., А.Б. и Т.С. написал рукопись при участии редакторов A.D., A.K., S.W., K.B.D. и G.J.C. Конкурирующие интересы: Все авторы были сотрудниками Scholar Rock на момент исследования и держателями акций и / или опционов на акции, за исключением П.Р. П. был консультантом Scholar Rock и получал от Scholar Rock гонорары за консультации и возмещение дорожных расходов. А.Б. является главным научным сотрудником Scholar Rock, Inc. C.J.M., A.D., C.L., C.C., S.W., K.B.D., J.W.J., S.L., A.D.C., A.B., G.J.C. и T.S. названы изобретателями в международной патентной заявке, связанной с этой работой (WO / 2020/014460; высокоаффинные, изоформ-селективные ингибиторы TGFβ1 и их использование), поданной Scholar Rock, Inc. Доступность данных и материалов: Все данные, связанные с это исследование присутствует в статье или дополнительных материалах.Последовательности SRK-181 были опубликованы в упомянутой выше заявке на патент. Код GSVA, используемый для анализа данных, доступен на Zenodo ( 61 ).
  • Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Отсутствие претензий к оригинальным правительственным работам США

Определение устойчивости опухоли к блокаде пути PD-1: рекомендации первого совещания Рабочей группы по устойчивости к иммунотерапии SITC

Введение

В иммунотерапии рака используется иммунная система для усиления противоопухолевого эффекта — чаще всего посредством активации опухолевых антиген-специфических Т-клеток — и включает в себя несколько методов, включая клеточную терапию, вакцины и моноклональные антитела, нацеленные на иммунные контрольные точки.1 2 В частности, ингибиторы иммунных контрольных точек (ICI) быстро изменили парадигму лечения онкологических больных в различных условиях и по показаниям, в первую очередь за счет обеспечения длительного клинического эффекта, определяемого как ответ опухоли или длительное стабильное заболевание (SD), в соответствии с критериями оценки ответа. при солидных опухолях (RECIST) версии 1.1, продолжительностью 6 месяцев и более3 — большему количеству пациентов по сравнению с химиотерапией и лучевой терапией. Тем не менее, у большинства пациентов есть заболевание, которое не проявляет либо клинического ответа, либо ответа с последующим прогрессированием на ингибиторы рецептора запрограммированной смерти 1 (PD-1) или его главного лиганда-лиганда запрограммированной смерти 1 (PD-L1).2 Таким образом, разработка эффективных иммунотерапевтических методов после ингибирования PD- (L) 1 для «устойчивых к ИКИ» популяций в различных условиях и сценариях лечения представляет собой серьезную проблему и неотложный приоритет для области онкологии.

Устойчивость к ингибиторам PD- (L) 1 клинически сложна и может проявляться в различные моменты времени во время лечения, в том числе сразу после начала лечения (первичная резистентность), через недели или месяцы после доказательства первоначального клинического эффекта (вторичная резистентность) или после лечение было прекращено по разным причинам.Из-за этой сложности и быстрого продвижения иммунотерапии в клинику единые определения устойчивости к ингибитору PD- (L) 1 еще не разработаны. Несмотря на то, что вначале предпринимались попытки охарактеризовать первичную резистентность и отсроченное прогрессирование после лечения ингибиторами PD- (L) 1 у пациентов с неоперабельной или метастатической меланомой, доступны 4 ограниченные данные, которые позволят выработать единообразные определения резистентности, применимые ко многим заболеваниям в вышеуказанные сценарии.Единообразные определения, подтвержденные комплексными наборами данных, окажут большую пользу при разработке лекарств, поддерживая стандартизованный набор в клинические испытания и соответствующие сравнения новых схем и подходов к лечению в клинических испытаниях после PD- (L) 1.

В отсутствие необходимых наборов данных клинических испытаний, согласованные с экспертами определения устойчивости оказались весьма полезными при множественных заболеваниях. Например, согласованные определения резистентности к агентам противоэпидермального рецептора фактора роста (EGFR) при раке легких, а также эндокринное лечение рака груди принесли большую пользу пациентам, сделав объединенный анализ и сделав выводы исследований более понятными, что впоследствии ускорило процесс исследования. внедрение в клинику новейших терапевтических средств.5 6

Признавая неудовлетворенную потребность в определениях устойчивости к ингибитору PD- (L) 1, а также понимая, что данные клинических испытаний устойчивости к ингибитору PD- (L) 1 ограничены и не являются исчерпывающими, Общество иммунотерапии рака ( SITC) создал рабочую группу для разработки согласованных экспертных определений клинических фенотипов резистентности к ингибитору PD- (L) 1, включая клинические определения первичной резистентности, вторичной резистентности и резистентности, развивающейся после прекращения терапии.Эта инициатива направлена ​​на обеспечение согласованности в исследованиях клинических и биологических проявлений резистентности к ICI, а также на создание структуры разработки лекарств, которая лучше оценивает терапевтическую эффективность новых агентов, вводимых отдельно или в комбинации с ингибиторами PD- (L) 1 после предшествующее лечение PD- (L) 1. Кроме того, поскольку многие клинические испытания в настоящее время не предназначены для последовательного сбора исчерпывающих данных об устойчивости к ICI, рабочая группа работала над выявлением областей возможностей в будущих клинических испытаниях для уточнения разработанных определений устойчивости к PD- (L) 1 путем содействия сбору и обмену данными и чтобы помочь будущим усилиям в других клинических условиях и / или методах.

Методы

SITC сформировал Целевую группу по устойчивости к иммунотерапии, собрав ряд заинтересованных сторон, включая представителей академических кругов, промышленности, государственных учреждений и других обществ, занимающихся онкологией, для выработки экспертных согласованных определений относительно устойчивости к PD-1 и PD -L1 ингибиторы. Полный список рабочей группы можно найти в дополнительных материалах онлайн.

Чтобы инициировать обсуждение, руководство рабочей группы SITC по устойчивости к иммунотерапии распространило среди ее членов опрос, характеризующий основные концепции клинических определений устойчивости к ингибитору PD- (L) 1.Члены рабочей группы были опрошены относительно трех клинических сценариев резистентности к ингибитору PD- (L) 1: первичная резистентность, вторичная резистентность и прогрессирование после прекращения лечения. Было решено, что в настоящее время эти усилия не будут сосредоточены на разработке определений устойчивости к ингибиторам цитотоксического Т-лимфоцит-ассоциированного антигена 4 (CTLA-4) или другим видам иммунотерапии.

В апреле 2019 года целевая группа провела личный семинар в Атланте, штат Джорджия, для обсуждения окончательных результатов опроса и выработки согласованных определений для трех сценариев устойчивости.Всего на встрече присутствовало 35 членов рабочей группы, которые были разделены на три рабочие группы. Встреча в основном состояла из обсуждений в рабочих группах по каждому из трех сценариев сопротивления и последующих обсуждений всей группой (рабочей группой) для формирования общих согласованных определений. Первоначальные результаты этой встречи были объединены в итоговый отчет в форме протокола, который был роздан членам рабочей группы и послужил основой для создания этой рукописи. Все участники рабочей группы рассмотрели согласованные определения и одобрили окончательный вариант рукописи, но не было единого согласия по каждому вопросу.По этой причине предостережения в отношении согласованных определений подробно описаны ниже, чтобы охватить широту разговора и сценарии, в которых определения могут не подходить идеально.

Основной текст

Общие комментарии к согласованным определениям

В целом члены рабочей группы согласились с тем, что цель этих усилий заключалась в выработке согласованных определений клинической устойчивости к ингибитору PD- (L) 1, которые были бы наиболее применимы к аспектам разработки лекарств и дизайн клинических испытаний.Рабочая группа согласилась с тем, что их усилия не должны быть направлены на выработку рекомендаций по лечению, и что наилучшее клиническое заключение должно при необходимости заменить любую из следующих рекомендаций.

Первоначальная тема обсуждения среди членов рабочей группы касалась разделения клинических сценариев резистентности PD- (L) 1. Рабочая группа признала, что растет число клинических испытаний, направленных на изучение резистентности к ингибитору PD- (L) 1, и что эти исследования обычно позволяют включать пациентов с прогрессирующим заболеванием, которые ранее получали ингибиторы PD- (L) 1.7 Члены рабочей группы в целом согласились с тем, что включение пациентов с разными клиническими сценариями резистентности PD- (L) 1 в одно и то же исследование, оценивающее новую терапию, может затруднить анализ активности и отрицательно повлиять на клиническую разработку других активных агентов. Таким образом, рабочая группа согласилась с тем, что клинический сценарий резистентности к ингибитору PD- (L) 1 имеет значение и должен приниматься во внимание при разработке согласованных определений.

Основываясь на этой предпосылке, рабочая группа специально обсудила, как пациент, у которого рак прогрессировал в течение первых нескольких недель терапии анти-PD- (L) 1, может иметь или не иметь биологически отличный механизм устойчивости по сравнению с пациентом, который испытал первоначальный ответ, но позже во время лечения наблюдалось прогрессирование заболевания.В конечном итоге рабочая группа пришла к выводу, что эти два клинических сценария аналогичны биологическим концепциям определения первичной (или de novo / врожденной) и вторичной (или приобретенной) резистентности, которые хорошо зарекомендовали себя в онкологии для других методов системного лечения. Следовательно, обсуждение обоих сценариев в отношении терапии ингибитором PD- (L) 1 было бы оправданным.

Однако рабочая группа отметила, что эти два клинических сценария могут отличаться от пациентов, у которых заболевание прогрессирует или рецидивирует после прекращения лечения после первоначального ответа, включая пациентов, заболевание которых прогрессирует после конечного курса адъювантной или неоадъювантной терапии.8 Таким образом, рабочая группа также согласилась обсудить клинические определения резистентности к ингибитору PD- (L) 1 в контексте прогрессирования заболевания после прекращения лечения и, более конкретно, для четырех условий: адъювантное лечение, неоадъювантное лечение и после прекращения терапии из-за различных аспектов. не связаны или связаны с токсичностью.

Члены рабочей группы отметили другие проблемы при определении клинической резистентности к терапии ингибитором PD- (L) 1, в первую очередь у тех пациентов, у которых на визуализации демонстрируется начальное прогрессирование с последующим ответом на продолжение терапии.2 9 Например, в раннем клиническом опыте применения анти-CTLA-4 антитела ипилимумаба при метастатической меланоме было очевидно, что пациенты могут испытывать долгосрочное клиническое улучшение, несмотря на очевидное прогрессирование заболевания на первом наборе или наборах изображений. В то время как у большинства пациентов в этих исследованиях, получивших клиническую пользу после лечения ипилимумабом, на изображениях наблюдалось однозначное уменьшение опухоли (как формально определяется стандартными критериями ответа RECIST и / или по оценке лечащего врача), уменьшение опухоли у некоторых пациентов произошло через несколько месяцев первоначальное лечение было прекращено на фоне начального рентгенологического прогрессирования.10 Признание того факта, что это явление, которое сейчас обычно называют «псевдопрогрессией», встречается примерно у 5–10% пациентов, получающих терапию анти-CTLA-4 или анти-PD- (L) 1, привело к разработке новых критериев визуализации. для измерения реакции / прогрессирования с одновременным учетом этого сценария11, 12 и изменил ведение пациентов, продвигая лечение за рамки традиционных определений прогрессирования, чтобы подтвердить устойчивость к ИКИ.13 На основе этих обсуждений рабочая группа решила рассмотреть соответствующие временные рамки и критерии ответа для подтверждение устойчивости к ингибитору PD- (L) 1 в трех согласованных клинических сценариях.

Наконец, рабочая группа сделала несколько общих предположений о популяции пациентов, к которым можно применить эти согласованные определения.

  1. Обсуждаемые определения были разработаны в первую очередь для солидных опухолей, поскольку было признано, что гематологические злокачественные новообразования имеют разные проявления заболевания и критерии ответа. Единые определения должны использоваться для всех солидных опухолей, за исключением опухолей, в которых стандартные критерии радиографического ответа обычно не используются, таких как глиобластомы, рак простаты, гепатоцеллюлярная карцинома и рак яичников, среди других.

  2. Все определения должны основываться на пациентах, получающих системную монотерапию анти-PD- (L) 1, а комбинации с другими ИКИ и другими типами системной или местной терапии в настоящее время не рассматриваются.

  3. Тип исследования (регистрационное и т. Д.) Не должен влиять на выработанные рекомендации и определения.

Было решено, что цель предоставления единообразных определений устойчивости к терапии ингибитором PD- (L) 1 заключалась в том, чтобы свести к минимуму вероятность того, что поздний ответ будет связан с последующими видами лечения, но рабочая группа признала, что имеющиеся данные для подтверждения такого отсечения были непоследовательными и ограниченными.Таким образом, был достигнут общий консенсус в отношении того, что определения должны быть нацелены на выявление популяции пациентов с вероятностью ≤5% иметь последующий ответ, если лечение продолжалось в прошлом прогрессии с монотерапией ингибитором PD- (L) 1 или если проводилась терапия монотерапией. ингибитор агента PD- (L) 1 был перезапущен независимо от промежуточной терапии, пороговое значение, которое они согласились, должно быть подтверждено на основе существующих наборов клинических данных от заинтересованных сторон в этой области, а также будущих данных, полученных с использованием текущих определений устойчивости целевой группы.

Первичная устойчивость

Предпосылки

Общее биологическое определение первичной устойчивости к ингибиторам PD- (L) 1 может быть определено как неспособность иммунных клеток вызывать противоопухолевый ответ при первоначальном воздействии лекарственного средства. была предложена устойчивость, включая, помимо прочего, неэффективное праймирование ответа Т-клеток, отсутствие распознавания опухоли из-за дефектной презентации антигена, неспособность Т-клеток перемещаться или эффективно проникать в жизнеспособные области опухоли, неспособность Т-клеток для устранения опухолевых клеток из-за подавления с помощью других контрольных точек, таких как иммунорецептор Т-клеток с доменами Ig и ITIM (TIGIT) и ген активации лимфоцитов 3 (LAG-3), обилие иммунных ингибирующих клеток, таких как M2-макрофаги, в опухоли, и другие.14 Однако клинические определения первичной резистентности к терапии ингибитором PD- (L) 1 не имеют единообразия во всех областях. В целях разработки лекарственного средства для анти-PD- (L) 1 рабочая группа сочла важным определить первичную резистентность с целью выявления пациентов, которым не поможет первоначальное и более продолжительное воздействие PD- (L). ) 1 монотерапия ингибитором.

Продолжительность воздействия лекарственного средства, необходимая для классификации первичной резистентности

Рабочая группа согласилась с тем, что важной особенностью любого клинического определения первичной резистентности является то, что оно должно отражать пациентов, которые действительно не получили «клинической пользы» от начальной терапии.Хотя термин «клиническая польза» может варьироваться в зависимости от области, в данном контексте он означает либо ответ опухоли, либо длительное стандартное отклонение, согласно RECIST версии 1.1, продолжающееся 6 месяцев или более, хотя временные рамки, возможно, придется пересмотреть при вялотекущих типах опухолей3. резистентность или отсутствие клинической пользы означает, что воздействие лекарственного средства было адекватным для индукции желаемого биологического эффекта, необходимого для противоопухолевой активности, и дополнительное воздействие лекарственного средства не будет эффективным; таким образом, было критически важно определить минимальную экспозицию для достаточного ингибирования PD- (L) 1, чтобы получить любую возможную клиническую пользу.Рабочая группа отметила, что исследования ингибиторов PD- (L) 1, которые имеют длительный период полужизни в кровотоке, включали повторное введение доз каждые 2–4 недели и не смогли выявить серьезного различия в эффективности или токсичности при дозах более 1 мг / кг, хотя некоторые заболевания могут вести себя по-разному (например, немелкоклеточный рак легкого в предварительном опыте применения ниволумаба), и для определенных ингибиторов PD- (L) 1 могут потребоваться более высокие дозы, чтобы вызвать противоопухолевую активность15-20. Исходя из этих данных, участники семинара в целом согласились с тем, что для оценки первичной резистентности будет достаточно двух курсов терапии.Таким образом, рабочая группа пришла к общему мнению о том, что пациент, у которого наблюдается прогрессирование заболевания после получения по крайней мере 6 недель воздействия ингибиторов контрольной точки PD- (L) 1, как правило, коррелирует с двумя полными циклами одобренного Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) PD — Терапия ингибитором (L) 1, но не более 6 месяцев может рассматриваться как первично-резистентное заболевание (таблица 1).

Таблица 1

Определения первичной и вторичной устойчивости в условиях запущенного заболевания

Требование к подтверждающему сканированию для подтверждения первичной устойчивости

Учитывая возможность отсроченного ответа на ингибиторы PD- (L) 1, рабочая группа согласилась с тем, что подтверждающий набор рентгенографических сканирований (или, в случае клинически измеримых поражений, физическое обследование) следует проводить для подтверждения резистентности у пациентов, у которых зарегистрировано прогрессирование по крайней мере через 6 недель после начала терапии.Рабочие группы разошлись во мнениях относительно сроков, в которые должно происходить это подтверждающее сканирование, но в целом согласились с диапазоном 4–12 недель после первоначального доказательства прогрессирования заболевания. В целом рабочая группа сочла, что пациенты должны продолжать терапию, если она считается клинически безопасной, до проведения второй оценки. Кроме того, был общий консенсус, что поздние ответы после быстрого и подтвержденного рентгенологического прогрессирования (например, отсутствие усадки), даже при коротких временных интервалах, таких как 4 недели, вероятно, возникают не более чем у 5% пациентов и вряд ли могут существенно повлиять на результаты последующих клинических испытаний, в которых может участвовать пациент (таблица 1).Рабочая группа осознает, что этот аспект необходимо будет дополнительно подтвердить с помощью новых данных.

Пациентов, у которых наблюдается ранняя токсичность, требующая стероидов и прекращение приема ингибиторов PD- (L) 1, трудно оценить первичную резистентность. В целях определения права на участие в будущих исследованиях, рандомизационной стратификации или более полного описания исходных характеристик в последующих исследованиях первичная резистентность должна быть задокументирована во время активной терапии или в течение 12 недель после последней дозы (см. Раздел о вторичной резистентности).Далее рассматривается сценарий, при котором пациенты прекращают терапию из-за слабой токсичности и в конечном итоге прекращают терапию более или равной 12 неделям после последней дозы (см. Раздел о прогрессировании после отмены ИКИ).

Одно исключение из требования о подтверждающих сканированиях касается пациентов, у которых наблюдается явное клиническое прогрессирование, определяемое как снижение состояния до лечения, непосредственно связанное с заболеванием или усиление связанных с заболеванием симптомов и рентгенологического прогрессирования.Рабочая группа признала, что продолжение терапии ингибитором PD- (L) 1 у пациентов с быстро прогрессирующим заболеванием будет небезопасным, и впоследствии группа указала, что клиническое заключение врача / клинического исследователя может диктовать немедленное изменение курса лечения, включая зачисление на клинические испытания без выполнения подтверждающих изображений.

Критерии оценки ответа для определения первичной резистентности

Рабочие группы разошлись в том, какие критерии оценки радиографического ответа следует использовать для измерения прогрессирования заболевания на ингибиторах PD- (L) 1.FDA обычно использует RECIST1.1 в качестве первичной конечной точки исследования, хотя альтернативные критерии ответа используются для солидных опухолей с участками / паттернами прогрессирования заболевания, которые недостаточно хорошо охарактеризованы с помощью RECIST1.1. Кроме того, иммунный RECIST (iRECIST) был специально разработан для решения проблем смешанных ответов и псевдопрогрессии, но до сих пор не является единственным критерием ответа, используемым для проверки эффективности терапии анти-PD- (L) 1 в регистрационных испытаниях.12 Одна рабочая группа не показал предпочтения между RECIST1.1 и iRECIST, в то время как одна рабочая группа предпочла использовать RECIST1.1 или iRECIST, соответственно. В целом рабочая группа пришла к выводу, что iRECIST еще не является стандартом и требует дополнительной проверки. Продолжаются усилия по разработке критериев ответа с использованием сканирования с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) для измерения изменений в поглощении фтордезоксиглюкозы (ФДГ), 21 однако рабочая группа пришла к консенсусу, что этот метод еще недостаточно разработан или утвержден. Все три рабочие группы согласились с тем, что ФДГ / ПЭТ может быть индикатором ответа на ингибиторы PD- (L) 1 и что интерпретация может быть затруднена из-за метаболически активных иммунных инфильтратов, которые могут сопровождать регрессирующие опухолевые поражения.Все три группы также заявили, что их в первую очередь заботит обеспечение того, чтобы не более 5% пациентов, включенных в клинические испытания, были неправильно определены как имеющие первично-резистентное заболевание, и считали, что либо RECIST1.1 с необходимыми подтверждающими сканированиями, описанными выше, либо iRECIST выполнит это. .

Пациенты с исходным SD по критериям RECIST1.1 или iRECIST представляют проблему. Было много дискуссий относительно продолжительности SD, которая будет обозначать реакцию, а не первичную резистентность.Общее мнение рабочей группы заключалось в том, что пациенты, которые изначально имели SD при визуализации, но соответствовали критериям прогрессирования заболевания в течение менее 6 месяцев после начала приема ингибиторов PD- (L) 1, считаются имеющими первичную резистентность.

Ключевые предостережения относительно первичной устойчивости

Все рабочие группы определили важные предостережения и исключения из общих определений первичной резистентности:

  1. Было решено, что рекомендации не следует применять к пациентам, которые прекратили лечение раньше из-за побочных эффектов и у последующее прогрессирование заболевания.Эти конкретные сценарии более подробно описаны в разделе «Развитие после прекращения лечения».

  2. Было признано, что сроки подтверждающих сканирований могут зависеть от гистологии опухоли, одним из примеров является мелкоклеточный рак легкого, где более короткий интервал может быть клинически более целесообразным из-за быстрого прогрессирования22.

  3. Степень и место роста опухоли на ингибиторах PD- (L) 1 могут определять вариабельные биологические объекты.Например, быстрый рост опухоли на всех участках, вероятно, отличается от изолированного прогрессирования или появления нового заболевания лимфатических узлов. Однако в целях разработки клинического исследования рабочая группа сочла, что вышеупомянутые определения следует применять в целом. Документация биопсии должна рассматриваться для прогрессирования только в участках лимфатических узлов. Пациентам с прогрессированием олигометастазов может быть целесообразна местная терапия для устранения прогрессирующего поражения.

  4. В многочисленных исследованиях изучали лечение, выходящее за рамки прогрессирования и / или повторного лечения после рецидива, с использованием альтернативных определений первичной резистентности, в том числе в контексте блокады PD- (L) 1.4 23 24 Таким образом, рабочая группа решила применить вышеописанное правило 5% ошибок, чтобы помочь сформировать определение первичного сопротивления, описанное в этой рукописи. Дальнейший опрос баз данных по результатам крупных клинических испытаний может помочь определить истинную частоту поздних ответов после начального прогрессирования, используя это определение первичной устойчивости, с пониманием того, что это может варьироваться в зависимости от лекарств и типов опухолей. Ожидается, что правило ошибки 5%, используемое для определения первичного сопротивления, будет подтверждено с использованием существующих баз данных и, в идеале, перспективных наборов данных.

Вторичная резистентность

Предпосылки

В целом рабочая группа рассматривала вторичную резистентность как ту, которая возникает, когда пациента лечат противоопухолевой терапией, имеет задокументированный, подтвержденный объективный ответ или пролонгированное стандартное отклонение (> 6 месяцев), и затем наблюдается прогрессирование заболевания на фоне продолжающегося лечения. Биологически этот тип устойчивости может возникать в результате адаптации опухолевых клеток и может включать одно или несколько эпигенетических, транскриптомных и / или протеомных изменений.Вторичная резистентность также может возникать в результате клональной селекции или клональной эволюции опухолевых клеток с ростом клонов, содержащих генетические изменения, придающие устойчивость к терапии.2 9 14 25 Также известные как «приобретенная резистентность», механизмы вторичной резистентности были описаны для каждого типа противоопухолевых препаратов. терапии и, что касается ингибиторов PD- (L) 1, исследование этих механизмов только началось. На сегодняшний день механизмы, определяющие устойчивость, включают мутации в генах гамма-ответа на интерферон JAK1 и JAK2,25–27 и изменения в путях презентации антигена, включая подавление и / или потерю бета-2-микроглобулина.26 Дополнительные потенциальные механизмы вторичной резистентности включают активацию белков, участвующих в альтернативных иммунных контрольных точках, таких как LAG-3 и Т-клеточный иммуноглобулин и муциновый домен 3 (TIM-3) 25, 28 29 Еще одним общим механизмом вторичной резистентности является повышение иммуносупрессивной активности. клеточные субпопуляции в микроокружении опухоли, такие как Т-регуляторные клетки (T-reg), миелоидные супрессорные клетки (MDSC) и макрофаги M2 (M2) 30 31

Как описано выше, рабочая группа обсудила необходимость различения пациентов с первичной и вторичной резистентностью и, в конечном итоге, пришла к консенсусу, что, поскольку кинетика и / или биологические механизмы могут быть потенциально разными, было бы полезно сделать это.Было также решено, что сгенерированные здесь определения не будут нацелены на рассмотрение этих биологических аспектов в настоящее время, а скорее будут использоваться для обеспечения того, чтобы пациенты проходили надлежащую сортировку для клинических испытаний, тестирующих новые лекарства или схемы приема лекарств, и не исключались из них. потенциальные методы лечения и / или клинические испытания. Исследования, посвященные лечению опухолей, резистентных к PD-1 / PD-L1, могут потенциально использовать сгенерированные определения для:

  1. Приемлемость пациентов (определение того, кто квалифицируется как имеющий первичную против вторичной резистентности).

  2. Стратификация в рандомизированных исследованиях (по первичной и вторичной устойчивости).

  3. Разработка планов анализа для клинических испытаний и в исследовательском сообществе

Продолжительность времени, необходимого для классификации вторичной резистентности

Для пациентов, получивших явную клиническую пользу (полный ответ (CR) или частичный ответ (PR)) от ингибиторов PD- (L) 1 рабочая группа обычно определяла вторичную резистентность как развитие прогрессирования заболевания через ≥6 месяцев после начала приема ингибиторов PD- (L) 1 при продолжении активной терапии.Сценарии с участием пациентов с SD (определяемые либо RECIST1.1, либо iRECIST), однако, не были так легко классифицированы в рамках определения вторичной резистентности и были дополнительно обсуждены в каждой из трех рабочих групп, а также среди рабочей группы в целом. Некоторые члены рабочей группы выразили мнение, что пациенты с медленным, устойчивым ростом заболевания, которым потребовалось 6 месяцев, чтобы квалифицироваться как прогрессирование заболевания, представляют собой другую группу пациентов, чем пациенты с любой степенью регресса заболевания, хотя их недостаточно для соответствия объективным критериям для PR. .В конечном итоге рабочая группа согласилась с тем, что пациенты с SD в течение ≥6 месяцев, у которых затем наблюдалось общее прогрессирование заболевания, независимо от измерений целевого поражения (т.е. общая регрессия опухоли <30% или рост опухоли <20%), будут считаться имеющими вторичное сопротивление (таблица 1). Рабочая группа отметила, что это определение может быть неприменимо к вялотекущим опухолям (см. Предостережения ниже).

Подтверждение вторичного сопротивления с подтверждающей визуализацией

Две из трех рабочих групп рекомендовали подтверждающее сканирование для подтверждения вторичного сопротивления.Как и в случае с рекомендациями по первичной резистентности, временные рамки, рекомендованные обеими рабочими группами в пользу подтверждения для такого сканирования, были в пределах 4–12 недель после доказательства начального прогрессирования заболевания. Кроме того, эти две рабочие группы согласились с тем, что прогрессирование заболевания должно быть подтверждено на ≥ двух метастатических участках / очагах у пациентов с множественными метастазами, и что бессимптомное узловое прогрессирование заболевания было недостаточным для классификации пациента как имеющего вторичную резистентность без патологического подтверждения.Третья рабочая группа не отдала предпочтения требованию подтверждающего сканирования. Обоснование, данное этой группой, заключалось в том, что частота ложноположительных результатов для определения прогрессирующего заболевания при терапии после клинической пользы, особенно в условиях CR или PR, меньше согласованного порогового значения 5%, основанного только на одном сканировании.

Как и в случае с первичной резистентностью, рабочая группа согласилась с тем, что пациентам с явным клиническим прогрессом не требуется подтверждающее сканирование для перехода к последующему лечению.

Критерии оценки ответа для определения вторичной устойчивости

Как и при обсуждении первичной устойчивости, рабочие группы разошлись в том, какие критерии ответа следует использовать для вторичной устойчивости (RECIST1.1 против iRECIST). В то время как одна группа не указала предпочтений, одна предпочла RECIST1.1, а другая — iRECIST. В целом рабочая группа согласилась с тем, чтобы выбранные критерии ограничивали количество ложноположительных результатов при классификации вторичной резистентности.В отсутствие конкретной проверки одного или обоих критериев оценки ответа было сочтено разумным использовать либо RECIST1.1, либо iRECIST, либо оба критерия для включения в клинические испытания.

Важные предостережения относительно вторичного сопротивления

Целевая группа выявила важные предостережения и исключения из общих рекомендаций по определению вторичного сопротивления.

  1. Было решено, что это определение не следует применять к пациентам, у которых наблюдается прогрессирование заболевания после прекращения лечения из-за побочных эффектов и которые не получали как минимум 6 месяцев терапии ингибитором PD- (L) 1.

  2. Комбинированные схемы, такие как схемы, включающие антитела против PD-1 и против CTLA-4, или химиотерапия / таргетная терапия и ингибиторы PD- (L) 1, требуют альтернативных критериев для определения вторичной резистентности. Следовательно, эти определения применимы только к монотерапии анти-PD- (L) 1, а не к схемам двойной терапии.

  3. Рабочей группе известно, что между приведенными выше определениями первичного и вторичного сопротивления существует «серая зона». В частности, пациенты с PR или CR при первом обследовании, у которых затем развивается прогрессирование заболевания в течение 6 месяцев после начала терапии ингибитором PD- (L) 1, разделяют характеристики обоих определений.Для упрощения и допуска к клиническим испытаниям рабочая группа определяет этих пациентов как имеющих первичную резистентность, поскольку эта резистентность развивается в течение 6 месяцев. Рабочая группа сочла, что это, вероятно, происходит в <5% случаев, но это потребует проспективной проверки посредством анализа клинических данных.

  4. Одна из рабочих групп задалась вопросом, потребуются ли конкретные определения вторичной резистентности для различных типов болезней. Хотя было отмечено, что существуют специфические для болезни качества реакции и прогрессирования в условиях ингибирования иммунных контрольных точек, консенсус был в том, что приведенное выше определение в целом применимо к солидным опухолям в контексте терапии ингибитором PD- (L) 1.

  5. Особенности прогресса пациента могут иметь значение. Например, было полное согласие с тем, что пациент, принимающий терапию ингибитором PD- (L) 1, который отреагировал на некоторые поражения, а затем имел многоочаговое прогрессирование заболевания, должен быть кандидатом для клинического исследования и будет классифицирован как имеющий вторичную резистентность. Однако не было полного единодушия в том, что прогрессирование на одном участке у пациентов с несколькими участками заболевания, особенно если рентгенологическое прогрессирование происходит только в лимфатических узлах или поражениях легких, поскольку рост поражения может быть преимущественно вызван воспалением.Был достигнут консенсус в отношении того, что биопсию следует проводить, когда это возможно, для подтверждения роста опухоли, но это не всегда убедительно или выполнимо. В целях определения вторичной резистентности рабочая группа будет включать пациента, если биопсия невозможна или не дает окончательного результата в определении вторичной резистентности, но признает, что этот сценарий может отличаться.

  6. Шести месяцев стандартного отклонения достаточно для определения клинической пользы для большинства типов опухолей. Однако могут потребоваться исключения для опухолей, которые имеют тенденцию к более медленному течению.

  7. Как и в случае определения первичной резистентности, эти рекомендации не основаны на эмпирических данных клинических испытаний, реестров пациентов или предыдущих исследований, изучающих лечение после прогрессирования и / или лечение после рецидива4 23 24 Сравнение этих определений с базами данных результаты крупных клинических испытаний и / или реестров пациентов могут быть полезны для определения истинной частоты второго ответа с дальнейшим использованием ингибиторов PD- (L) 1 после первоначального ответа и прогрессирования, так как это может варьироваться между лекарствами и типами опухолей, которые снова ожидаемо подтвердит предложенное правило ошибки 5%.

Прогрессирование заболевания после прекращения или прекращения приема ингибиторов контрольной точки

Предпосылки

Одноагентные ингибиторы PD- (L) 1 эффективны при запущенном заболевании при множественных типах опухолей, что приводит к общей выживаемости, а в некоторых случаях приводит к долгосрочные реакции после лечения2. Кроме того, эти агенты все чаще используются в условиях адъювантной и неоадъювантной терапии, где применяется фиксированная продолжительность лечения. Анти-PD-1 терапия была одобрена FDA в качестве адъювантной терапии для пациентов с меланомой32, 33 и дополнительные адъювантные / неоадъювантные показания в настоящее время проходят клинические испытания.7 Основываясь на увеличении использования ингибиторов PD- (L) 1 в этих условиях, рабочая группа решила обсудить адъювантную и неоадъювантную терапию в контексте прогрессирования после прекращения ИКИ. Параллельно с этим, учитывая тот факт, что лечение может быть прекращено при метастазах либо вторично по отношению к токсичности, либо после достижения максимального эффекта, рабочая группа также рассмотрела этот параметр в своих обсуждениях.

Эта форма сопротивления может иметь элементы первичного или вторичного сопротивления, как определено выше.Например, долгосрочное выживание без болезней после адъювантной терапии достигается либо за счет полного устранения опухолей, либо за счет постоянной противоопухолевой иммунологической памяти. Рецидив после прекращения терапии можно объяснить кинетикой рецидива заболевания с ранним рецидивом при адъювантной терапии, напоминающим первичную резистентность, и поздним рецидивом после прекращения терапии и начальным контролем болезни, напоминающим вторичную резистентность. Таким образом, лежащие в основе механизмы могут быть связаны с неспособностью иммунотерапии уничтожить злокачественные клетки из-за отсутствия прайминга и активации опухолевых антиген-специфических иммунных клеток или неспособности цитолитических клеток проникать и / или убивать опухолевые клетки, что соответствует сценарию. с описанными выше потенциальными механизмами первичного сопротивления.С другой стороны, адъювантная иммунотерапия может вызвать новое иммунное равновесие, которое в конечном итоге приводит к достаточному иммунному редактированию оставшихся опухолевых клеток, что приводит к появлению устойчивых клонов или истощению иммунных клеток, вторичному по отношению к различным механизмам. Последний сценарий больше соответствовал бы определениям вторичной или приобретенной устойчивости, представленным выше. Однако отмеченное различие между этими двумя настройками и сопротивлением в расширенных настройках заключается в том, что большая часть опухоли не присутствует в настройках адъюванта.

Кроме того, прекращение терапии имеет фармакокинетические и фармакодинамические последствия. Имеющиеся данные указывают на то, что занятость рецепторов ниволумабом против PD-1 начинает снижаться через 2-3 месяца после приема разовой дозы препарата и, как правило, не определяется через 6 месяцев.15 Признавая, что активация Т-клеток может продолжаться при отсутствии занятости рецептора, эти временные рамки служат руководством для определения сопротивления в данной обстановке.

Резистентность во время и после адъювантной терапии

Использование ингибиторов PD- (L) 1 на ранних стадиях заболевания, особенно в адъювантном режиме, выдвигает на первый план новые проблемы:

  1. Нет прямого установленного метода оценки ответа микрометастатической остаточной болезни до терапии; поэтому единственным надежным показателем активности является время рецидива после прекращения терапии.

  2. Концептуально более низкое бремя микроскопических заболеваний может стохастически уменьшить появление устойчивых клонов. Однако возможно, что устойчивые клоны, возникающие в этих условиях, могут быть биологически более агрессивными. В любом случае, возможно, что резистентность, возникающая после адъювантного лечения, может включать механизмы, отличные от тех, которые наблюдаются при первичной резистентности или приобретенной резистентности.

  3. В этом случае существует более низкий порог для прекращения терапии из-за токсичности, что затрудняет оценку взаимодействия токсичности и эффективности.

Продолжительность времени во время или после адъювантного лечения, необходимого для классификации устойчивости

В рабочей группе велась серьезная дискуссия относительно сроков, по истечении которых пациент может быть признан имеющим резистентное заболевание в условиях адъювантной терапии. Пациентов можно разделить на две группы: «адекватное лечение» и «неадекватное лечение». В группу адекватного воздействия вошли пациенты, у которых заболевание прогрессировало в течение 6–12 недель после последней дозы адъювантной терапии; после обсуждения все рабочие группы в целом согласились с тем, что эту популяцию пациентов следует рассматривать как имеющих первичную резистентность к ингибиторам контрольных точек и в дальнейшем следовать определениям / протоколам, описанным выше.Популяция «неадекватного воздействия» включает пациентов, у которых заболевание прогрессировало более чем через 12 недель после приема последней дозы ингибитора контрольных точек (таблица 2). Две из трех рабочих групп предложили 6 месяцев в качестве порогового значения для популяции «рецидив после прекращения лечения», но участники в конечном итоге согласились на 12 недель в качестве консенсуса, чтобы ограничить потенциальную путаницу в случае прогрессирования заболевания у пациента после адъювантной терапии. в период от 12 недель до 6 месяцев (таблица 2).

Таблица 2

Определения устойчивости к адъювантной терапии

Требование к подтверждающему сканированию для подтверждения устойчивости во время адъювантной терапии

Члены рабочей группы в целом согласились с тем, что пациенты с прогрессирующим и / или рецидивирующим заболеванием после адъювантной терапии должны пройти биопсию для подтверждения рецидива.Ни одна из рабочих групп не указала на необходимость подтверждающего рентгенографического сканирования (таблица 2).

Важные предостережения относительно устойчивости во время адъювантной терапии

Все рабочие группы определили исключения из общих рекомендаций по устойчивости во время адъювантной терапии.

  1. Одна рабочая группа предположила, что пациент, у которого заболевание прогрессирует более чем через 6 месяцев после приема последней дозы ингибитора контрольной точки и не имеет свидетельств клинического ухудшения и / или снижения работоспособности, может все же ответить на повторное испытание с помощью одного агента PD. — (L) 1, и что такое повторное испытание может потребоваться для проверки сопротивления.

  2. Состоялось серьезное обсуждение того, как классифицировать пациентов с резистентным заболеванием в условиях адъювантной терапии. В то время как рабочая группа в целом согласилась разделить пациентов по времени, прошедшему от последней дозы до рецидива (адекватное воздействие против неадекватного воздействия, описанное выше), альтернативной предложенной классификацией был «ранний рецидив» (PD через 6–12 недель после последней дозы адъюванта). терапии) по сравнению с «поздним рецидивом» (PD> 12 недель после последней дозы адъювантной терапии), с пониманием того, что пациенты с поздним рецидивом могут иметь> 5% шанс ответить на повторный вызов.По мере накопления данных приоритет будет отдаваться пересмотру того, как классифицировать пациентов в условиях адъювантной терапии.

  3. Вторая группа предположила, что по мере развития технологий можно использовать фармакодинамическую оценку занятости рецепторов, чтобы установить, устойчив ли пациент, получающий адъювантное лечение, к ингибиторам PD- (L) 1.

Устойчивость во время и после неоадъювантной терапии
Общие определения устойчивости во время неоадъювантного лечения

Использование неоадъювантной иммунотерапии остается новой практикой и, как правило, проводится в рамках клинических испытаний.Это обсуждение произошло в рабочей группе в ожидании увеличения использования этого пространства, и, возможно, потребуется вернуться к нему после того, как станет доступна критическая масса клинических данных. Рабочая группа в целом согласилась с тем, что определения устойчивости в первичных или вторичных условиях также могут применяться к пациентам, получавшим неоадъювантную терапию. Однако одно из основных отличий от адъювантного режима заключается в том, что на момент начала терапии имеется макроскопическая опухоль, и в неоадъювантном режиме возможна объективная оценка опухоли рентгенологически или клинически очевидного заболевания для иммунотерапии.В целом было согласовано, что пациенты, у которых наблюдается значительный патологический ответ на иммунотерапию (полный ответ, близкий к нему ответ или серьезный частичный ответ) до операции, а затем рецидив после операции, могут лучше соответствовать определению вторичной резистентности, в то время как пациенты, которые не достигают патологического ответа до операции, более соответствуют первичной резистентности.34 35 Таким образом, повторное терапевтическое лечение может не потребоваться, если у пациента были доказательства первичной резистентности к ингибиторам PD- (L) 1 во время неоадъювантного лечения, что продемонстрировано отсутствием патологического ответа в то время хирургии (таблица 3).Если в схеме лечения применяется адъювантная иммунотерапия, рецидив, возникающий во время или после неоадъювантной фазы, в противном случае следует рассматривать как аналогичный режиму адъювантной терапии.

Таблица 3

Определения устойчивости к неоадъювантной терапии

Прогрессирование заболевания после прекращения терапии в условиях метастатического заболевания
Общие определения устойчивости после прогрессирования заболевания после прекращения приема ингибиторов PD- (L) 1 на поздних стадиях

общее согласие с тем, что прекращение терапии в таких условиях может быть вызвано различными причинами, включая завершение схемы лечения, достижение «максимальной пользы» (CR или PR), социальные и / или финансовые факторы, предпочтения пациента и возникновение токсичность.Основываясь на этих возможных вариантах, рабочая группа рассмотрела две основные категории пациентов: тех, кто прекратил лечение по причинам, не связанным с токсичностью, и тех, кто прекратил лечение из-за неблагоприятного события.

В случаях, когда пациент с метастатическим заболеванием прекратил прием ингибиторов PD- (L) 1 по какой-либо причине, не связанной с токсичностью, и не имел доказательств предшествующей клинической пользы во время терапии, рабочая группа сочла, что этих пациентов лучше всего определять как имеющих первичную резистентность и не будет пользы от терапевтического повторного вызова (таблица 4).Кроме того, рабочая группа сочла, что подтверждающее сканирование в этой популяции было бы ненужным.

Таблица 4

Определения устойчивости после прекращения лечения метастатического заболевания

С другой стороны, рабочая группа в целом считала, что пациенты, которые испытали клиническую пользу (PR / CR), прекратили лечение из-за максимальной пользы, дизайна исследования или других социальных / финансовых обоснование, может быть рассмотрено как устойчивое на основании времени, в течение которого пациенту была введена последняя доза ICI до появления признаков прогрессирующего заболевания.Рабочая группа обычно рекомендовала, чтобы пациенты с признаками прогрессирующего заболевания ≤12 недель после приема последней дозы ингибитора контрольных точек могли быть определены как имеющие вторичную резистентность (таблица 4), и рекомендовала подтверждающее сканирование в этих сценариях. Для пациентов с прогрессирующим заболеванием> 12 недель после прекращения лечения рабочая группа сочла, что повторный прием ингибитора PD- (L) 1 потенциально может дать клиническую пользу (превышающий порог 5%), и поэтому сочла, что будет трудно классифицировать заболевание как устойчивы без повторного терапевтического испытания.

Для пациентов, у которых развивается токсичность и которые не могут продолжать терапию ингибитором PD- (L) 1, рабочая группа обычно предлагала, чтобы соответствующее определение резистентности было продиктовано тем, получил ли пациент клиническую пользу до прекращения лечения. Рабочая группа в целом согласилась с тем, что пациента, который прекратил терапию ингибитором PD- (L) 1 из-за токсичности и не имел доказательств первоначальной клинической пользы, лучше всего классифицировать как пациента с первичной резистентностью. В качестве альтернативы, если у пациента была выявлена ​​полная или частичная реакция до прекращения лечения из-за токсичности, а затем наблюдалось прогрессирование заболевания, рабочая группа обычно рекомендовала, как указано выше, для пациентов, которые прекратили лечение по другим причинам, чтобы пациенты с признаками прогрессирующего заболевания ≤12 недель после их последнего доза ингибитора контрольной точки может быть определена как имеющая вторичную резистентность (таблица 4), и рекомендуется подтверждающее сканирование в этих сценариях.Для пациентов с прогрессирующим заболеванием> 12 недель после прекращения лечения рабочая группа сочла, что повторный прием ингибитора PD- (L) 1 потенциально может дать клиническую пользу (превышающий порог 5%), и поэтому сочла, что будет трудно классифицировать заболевание как устойчивы без повторного терапевтического испытания.

Важные предостережения относительно устойчивости после прогрессирования заболевания после прекращения лечения
  1. Целевая группа признала, что пациентов можно лечить с помощью интеркуррентной терапии, включая химиотерапию, лучевую терапию и / или таргетную терапию, после прекращения терапии ингибитором PD- (L) 1 и спросил, как определить сопротивление в этой популяции.Рабочая группа отметила, что эти подходы могут потенциально изменить микросреду опухоли, что может повлиять на активность последующих комбинированных схем на основе PD- (L) 1. После долгого обсуждения рабочая группа в целом пришла к выводу, что этих пациентов следует включить в текущие определения и что резистентность все же следует определять, используя дату последней известной дозы ингибитора PD- (L) 1, как систематический анализ, способный определить скорость ответа на Терапия ингибитором PD- (L) 1 после интеркуррентного лечения в настоящее время недоступна в этой области.

  2. Было высказано предположение, что пациенты, которые получили первоначальную клиническую пользу от ингибиторов PD- (L) 1, прекратили терапию, а затем имели прогрессирующее заболевание> 12 недель после их последней дозы, могут быть надлежащим образом рандомизированы для лечения одним агентом в условиях рандомизированное контролируемое исследование, аналогичное испытаниям, оценивающим лечение ICI первой линии при меланоме, которое в настоящее время позволяет пациентам, получившим адъювантную терапию> 6 месяцев до рецидива.

  3. Как и в случае с другими определениями устойчивости, рабочая группа признает ограниченные доступные данные для проверки и будет пересматривать эти определения по мере разработки и появления новых наборов данных

Выводы

По мере того, как иммунотерапия продолжает расширяться в онкологическую практику, уточнение существующей базы знаний об ответной реакции и резистентности опухолей будет необходимо для максимального увеличения терапевтического потенциала и направления разработки новых методов лечения.В качестве побочного продукта быстрого внедрения ингибиторов контрольных точек, в частности ингибиторов PD-1 и PD-L1, область должна адаптироваться к специфическим свойствам этих новых методов лечения, включая увеличенный период полувыведения, различную кинетику ответа опухоли, воспалительные реакции, имитирующие заболевание. прогрессирование и неоднородность ответа внутри людей. Чтобы помочь будущей разработке лекарств в условиях предшествующего воздействия PD- (L) 1 и обеспечить постоянный импульс в этой области, SITC созвал рабочую группу, чтобы помочь в определении клинических аспектов устойчивости к ингибитору PD- (L) 1.Для трех различных сценариев клинической резистентности — первичной резистентности, вторичной резистентности и прогрессирования после прекращения лечения — рабочая группа уточнила временные рамки, охарактеризовала необходимость подтверждающего сканирования и определила важные предостережения, которые должны быть легко исследованы в будущих доклинических и клинических исследованиях.

Основная цель этой целевой группы состояла в том, чтобы идентифицировать «резистентную» популяцию PD- (L) 1, которая при включении в последующее клиническое испытание будет иметь ложноположительный показатель активности нового агента не более 5%.Хотя рабочая группа опиралась на существующие данные клинических испытаний и опыт лечения пациентов этими агентами, важно отметить, что эти определения не были основаны на исчерпывающем анализе существующих наборов данных. Целевая группа определила ключевые вопросы для данной области, которые следует рассмотреть в сочетании с приведенными выше определениями (вставка 1). Поскольку многие из этих вопросов связаны с последующим анализом данных с данными клинических испытаний заинтересованных сторон, одним из ключевых пунктов действий на этом заседании было то, что рабочая группа должна облегчить дальнейшее обсуждение с исследователями, отраслевыми спонсорами, Национальным институтом рака и FDA для предоставления наборов данных. которые могут быть запрошены, чтобы помочь проверить и уточнить эти определения.Хотя есть надежда, что эти анализы потенциально могут быть завершены до публикации рекомендаций целевой группы, было сочтено, что неудовлетворенная потребность в практических определениях слишком велика, чтобы ждать такого уровня подтверждения. Таким образом, опубликованные здесь определения следует рассматривать как первую версию рекомендаций рабочей группы, и можно ожидать дополнительных обновлений, когда появятся новые данные или появятся другие факторы, влияющие на достоверность текущей итерации. Рабочая группа единодушно согласилась с тем, что эти усилия были сосредоточены исключительно на определении сценариев клинической устойчивости к ингибиторам PD- (L) 1, но признали важность дальнейшего понимания биологии, лежащей в основе каждого из этих клинических сценариев.Ожидается, что описанные выше определения могут помочь при трансляционном анализе раскрыть ключевые биологические вопросы.

Вставка 1

Ключевые вопросы и аспекты устойчивости к иммунотерапии, определенные рабочей группой

  • Выявление степени псевдопрогрессии с описанными определениями с использованием больших баз данных клинических исследований

  • Характеристика отдаленных клинических исходов пациентов с частичным ответом / стабильным заболеванием <6 месяцев

  • Сбор и анализ данных, касающихся пациентов с первичной / вторичной резистентными опухолями, повторно лечившихся с помощью запрограммированных ингибиторов лиганда смерти 1

  • Определение устойчивости для отдельных лекарств

  • Определение устойчивости для различных типов опухолей

ВОЗ EMRO | Краткое сообщение: Первичная и приобретенная лекарственная устойчивость при детском туберкулезе | Том 12, выпуск 6

PDF версия

с.Халилзаде, 1 M.R. Boloorsaz, 1 A. Safavi, 1 P. Farnia 1 и A.A. Велаяти 1

РЕФЕРАТ Это исследование определило характер устойчивости Mycobacterium tuberculosis к 4 противотуберкулезным препаратам первой линии у детей с туберкулезом легких в Иранском национальном научно-исследовательском институте туберкулеза и болезней легких с 1999 по 2004 год. Было 350 детей с положительными культурами. за период исследования: 7 (2%) были устойчивы хотя бы к одному из 4 противотуберкулезных препаратов.Первичная резистентность была выявлена ​​в 4 случаях, вторичная — в 3 случаях. Большинство заболевших (6) были среди афганских беженцев. Устойчивость к рифампицину как при первичной, так и при вторичной резистентности была высокой, что свидетельствует о том, что дети в Исламской Республике Иран сталкиваются с угрозой передачи лекарственно-устойчивого туберкулеза.

Pharmacorésistance primaire et acquise dans la tuberculose de l’enfant

РЕЗЮМЕ Предварительное исследование детерминированной схемы устойчивости Mycobacterium tuberculosis в 4 противотуберкулезных препаратах с предварительным назначением после участия детей в Национальном медицинском институте туберкулеза в 2004 году.У вас есть 350 детей, получивших положительные результаты в области культуры за период обучения: 7 (2%) постоянно не сопротивлялись в течение всего периода обучения. Une résistance primaire a été détectée chez 4 cas et une résistance secondaire chez 3 cas. La plupart des cas (6) étaient des réfugiés afghans. La résistance à la rifampicine — primaire et secondaire — était élevée, ce qui montre que les enfants en République islamique d’Iran sont разоблачает угрозу передачи туберкулезной фармакологии.

1 Национальный исследовательский институт туберкулеза и болезней легких, больница Массих Данешвари, Университет медицинских наук Шахида Бехешти, Тегеран, Исламская Республика Иран (переписка с А. Сафави: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра ).
Поступила: 11.08.04; принято: 12/05/05
EMHJ, 2006, 12 (6): 909-914


Введение

Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ), определяемый как устойчивость как минимум к изониазиду и рифампицину, представляет собой растущую проблему для здоровья и серьезную проблему для программ борьбы с туберкулезом (ТБ) [1].Устойчивые к лекарствам штаммы Mycobacterium tuberculosis появляются всякий раз, когда сильно инфицированные люди не получают адекватного лечения, когда лечение было прервано или когда к неэффективной схеме было добавлено одно лекарство [2]. Дети с МЛУ-ТБ обычно имеют первичную резистентность и инфицированы штаммами, передаваемыми от взрослых с МЛУ-ТБ. Показано, что скорость передачи штаммов МЛУ-ТБ у детей такая же, как и у взрослых [3].

Частота лекарственной устойчивости ТБ, особенно МЛУ-ТБ, обычно высока в странах, которые Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) классифицирует как страны с плохими программами борьбы [4,5].Неоптимальные программы контроля могут привести к быстрому возникновению лекарственной устойчивости не только в развивающихся странах, таких как Индия [6], но и среди населения в развитых странах, таких как Нью-Йорк [7].

Согласно отчетам из Южной Африки, частота резистентности к изониазиду составляла 5,6%, а частота МЛУ-ТБ составляла 1% среди детей в возрасте до 5 лет [8]. Информация о типах чувствительности изолятов M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам является важным аспектом борьбы с туберкулезом.Эпиднадзор и анализ местных показателей лекарственной устойчивости ТБ полезны для выявления и мониторинга распространения штаммов МЛУ, что указывает на качество борьбы с ТБ в стране [9]. Однако исследований лекарственно-устойчивого туберкулеза у детей мало, и мало данных из развивающихся стран.

Целью этого исследования было определение распространенности лекарственной устойчивости среди детей с ТБ в специализированной больнице в Тегеране, Исламская Республика Иран, и сравнение клинических и радиологических характеристик лекарственно-устойчивого и лекарственно-чувствительного ТБ среди этих детей. .

Методы

Настройка

Это ретроспективное исследование проводилось в период с января 1999 г. по август 2004 г. в Национальном научно-исследовательском институте туберкулеза и болезней легких, специализированном центре по туберкулезу и легочным заболеваниям в Тегеране. Режим ДОТС [лечение под непосредственным наблюдением, короткий курс] используется для всех случаев ТБ с 1995 года.

Клинические данные

Клинические карты были проанализированы для всех детей с положительными культурами на M. tuberculosis, которые были госпитализированы в течение периода исследования.Были собраны данные о предыдущей профилактике или лечении туберкулеза, а также о том, имели ли они тесный контакт со взрослым, больным легочным туберкулезом. Место заражения было зафиксировано. Отмечены результаты кожной туберкулиновой пробы (проба Манту при внутрикожной инъекции; 0,1 мл 5 туберкулиновых единиц). Индурация ≥ 15 мм после тестирования считалась достоверно положительной в соответствии с критериями ВОЗ [10]. Были оценены и классифицированы рентгенограммы грудной клетки или компьютерная томография.

Определение первичной и приобретенной устойчивости M.изоляты туберкулеза

Первичная устойчивость определялась как наличие устойчивости к одному или нескольким противотуберкулезным препаратам у штаммов, полученных от пациентов, никогда не получавших лечения. Приобретенная устойчивость была определена как устойчивость к одному или нескольким противотуберкулезным препаратам в штаммах, выделенных от пациентов, ранее получавших противотуберкулезное лечение [11]. МЛУ-ТБ был определен как заболевание у ребенка в возрасте до 15 лет с обнаружением ТБ при рентгенографии и домашнем контакте с МЛУ-ТБ или посевом, демонстрирующим M.туберкулез с устойчивостью как минимум к изониазиду и рифампицину по пропорциональной методике [12].

Тестирование лекарственной чувствительности
У всех детей было получено

образцов мокроты или промывания желудка. Все положительные культуры обычно отправляются в лабораторию Национального исследовательского института туберкулеза и болезней легких для тестирования чувствительности к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу. Культивирование проводили на среде Левенштейна – Йенсена. Во всех случаях было проведено тестирование на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

Лабораторные процедуры определения лекарственной устойчивости были следующими: образцы переваривали и обеззараживали методом N-ацетил-1-цистеина NaOH, как описано Кентом и Кубицей [13], с конечной концентрацией NaOH 1%. После дезактивации из отложений готовили мазки для кислотного быстрого окрашивания по Цилю – Нильсену. Затем по 0,2 мл обработанного образца инокулировали на каждый из 4 скосов Левенштейна – Йенсена (приготовленных в местной лаборатории). Все инокулированные среды инкубировали при 37 ° C.Засеянную твердую среду Левенштейна-Йенсена проверяли еженедельно в течение 8 недель. Все положительные результаты были подтверждены окрашиванием по Цилю – Нильсену. Колонии с поверхности среды Левенштейна – Йенсена переносили в стерильные пробирки, содержащие 6–8 стеклянных шариков и 3,0 мл бульона Миддлбрука 7H9. Подвеска была отрегулирована по 1 стандарту МакФарланда. После этого были приготовлены разведения 1/10, 1/1000 и 1/100000 и внесены в содержащие лекарственное средство среды и контроли. Концентрации препарата были следующими: 0.2 мкг / мл изониазида, 40 мкг / мл рифампицина, 2 мкг / мл этамбутола и 4 мкг / мл стрептомицина по пропорциональному методу [14].

Результаты

За 5-летний период с января 1999 г. по август 2004 г. 350 детей с туберкулезом были госпитализированы в Национальный научно-исследовательский институт туберкулеза и болезней легких. Среди них было выявлено 7 детей с МЛУ-ТБ: 5 мальчиков и 2 девочки со средним возрастом 14,5 лет (диапазон 14–15 лет). Таким образом, частота устойчивости к МЛУ-ТБ составляет 2% среди детей, поступивших в наш центр.Тесты на ВИЧ были отрицательными во всех 7 случаях. У всех детей был легочный туберкулез, и не было обнаружено никаких доказательств внелегочного поражения. Большинство случаев было среди афганских иммигрантов: 6 детей по сравнению с 1 ребенком иранской национальности.

Клинические и рентгенологические данные

Мы просмотрели записи всех 7 детей. Наиболее частым симптомом был продуктивный кашель, обнаруженный у 6 детей (86%). Другими симптомами были лихорадка у 5 детей (71%), кровохарканье у 3 (43%), одышка и ночной озноб у 2 (29%) и потеря веса у 1 ребенка (14%).

Были проанализированы рентгенологические изменения в 7 случаях. Среди 6 пациентов, у которых были доступны рентгенологические результаты, наиболее частой находкой была инфильтрация в паренхиме легких, которая наблюдалась в 4 случаях (57%). Наряду с кальцификацией, кавитацией, внутригрудной лимфаденопатией, пневмотораксом, фиброзом и ретикулонодулярными изменениями по 1 случаю (14%).

Результаты чувствительности

Результаты исследования лекарственной чувствительности показали, что из 7 случаев 6 (86%) имели резистентность к рифампицину, 5 (71%) к изониазиду, 4 (57%) к стрептомицину и 2 (29%) к этамбутолу.Кроме того, 2 случая (29%) имели резистентность ко всем 4 препаратам (рифампицин, изониазид, стрептомицин, этамбутол), 1 случай (14%) к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и 2 (29%) к изониазиду, рифампицину, 1 случай ( 14%) имели резистентность только к стрептомицину, а 1 случай (14%) имел резистентность только к рифампицину.

Из 7 детей 6 (86%) имели семейный контакт с ТБ. Только 1 афганский мальчик (14%) с устойчивостью к изониазиду и рифампицину не имел тесного контакта с другими больными туберкулезом.Чаще всего контактировали мать и дядя (2 случая, 29%). Контакт с братом и отцом отмечен в 1 случае (14%).

Структура лекарственной устойчивости показала первичную резистентность в 4 случаях (57%) и вторичную резистентность в 3 случаях (43%). Тесты на первичную резистентность показали, что 3 случая (77%) имели резистентность к рифампицину, 3 (77%) к изониазиду, 2 (50%) к стрептомицину и 1 случай (25%) имели положительную резистентность к этамбутолу. В группе вторичной резистентности 3 случая (100%) имели резистентность к рифампицину, 2 (66%) к изониазиду, 2 (66%) к стрептомицину и 1 случай (33%) имели положительную резистентность к этамбутолу.

Обсуждение

Эпиднадзор за устойчивостью к противотуберкулезным препаратам в обществе позволяет оценить успех национальной программы борьбы с туберкулезом и дает представление о подходящих схемах приема лекарств для использования в будущем [15]. Первичные или начальные модели устойчивости отражают передачу штаммов с лекарственной устойчивостью, но поскольку ТБ у детей является признаком недавней передачи ТБ в сообществе, частота лекарственной устойчивости у детей, особенно детей младше 5 лет, отражает более точную оценку. текущей ситуации [1,15].

Наиболее полное на сегодняшний день исследование было проведено в течение 24 лет (1961–1984) в больничном центре округа Кингс, Нью-Йорк [16,17]. Из 374 детей, прошедших скрининг на первичную лекарственную устойчивость, 16,3% имели устойчивость к одному или нескольким противотуберкулезным препаратам. Устойчивость к изониазиду была относительно стабильной на уровне 10%, но для рифампицина, который был введен в этот период, резистентность росла [16].

В другом исследовании 2000 г. из 306 детей с положительной культурой на M. tuberculosis, 6.9% были устойчивы к изониазиду и 3,2% имели МЛУ-ТБ [18]. Исследование 11480 детей с туберкулезом в США в 1993–2001 гг. Показало, что среди детей с положительной культурой лекарственная устойчивость к изониазиду и рифампицину составляла 7,3% и 1,6% соответственно [19].

В развивающихся странах нет всеобъемлющих исследований распространенности лекарственной устойчивости у детей, хотя имеются некоторые отчеты о статусе лекарственной устойчивости среди взрослого населения. В 2001 году Аль-Марри в Катаре провела исследование [20].В этом исследовании из 406 случаев с положительной культурой на M. tuberculosis по крайней мере 15% имели устойчивость к 1 из 4 противотуберкулезных препаратов. Из них 95% имели первичное и 5% вторичное сопротивление. Также максимальная устойчивость наблюдалась к изониазиду у 15%. В нашем исследовании из 350 детей 7 случаев имели устойчивость как минимум к 1 из 4 противотуберкулезных препаратов, а 5 (1,4%) имели МЛУ-ТБ. Частота МЛУ-ТБ среди больных ТБ, поступивших в наш центр, составила 2%, что ниже аналогичных данных и исследований, опубликованных Аль-Марри [20].Низкая распространенность в ретроспективном исследовании может быть связана с вероятностью пропуска случаев по сравнению с проспективным исследованием; однако в нашем исследовании посев и антибиотики были выполнены во всех случаях туберкулеза, о которых было сообщено в этот центр. Поскольку всестороннее и тщательное исследование лекарственной устойчивости у детей в Исламской Республике Иран не проводилось, точных данных и цифр для сравнения не существует. Как указано в результатах, из 7 пациентов с МЛУ-ТБ 6 были афганскими иммигрантами.Столь высокая доля иммигрантов с МЛУ-ТБ может быть объяснена их низким социально-экономическим статусом, недоеданием, задержкой постановки диагноза и нерегулярным использованием противотуберкулезных препаратов, которые действуют как предрасполагающие факторы в этой группе пациентов.

Между тем, у 4 (57%) детей была выявлена ​​первичная резистентность и у 3 (43%) вторичная резистентность, что можно объяснить тем, что первичная резистентность чаще встречается у детей [3]. В нескольких исследованиях сообщается об очень низком уровне устойчивости к рифампицину [3,21,22].Однако в нашем исследовании МЛУ-ТБ устойчивость к рифампицину как в случае первичной, так и вторичной устойчивости была высокой. По нашим результатам, у 6 пациентов (85%) была резистентность к рифампицину; По 3 (42%) от каждой из первичных и вторичных групп резистентности. Также, что касается устойчивости к изониазиду, 3 (75%) из группы первичной устойчивости и 2 (66%) из группы вторичной устойчивости показали устойчивость. При этом устойчивость к этамбутолу и стрептомицину в обеих группах была сходной. Различные обстоятельства, такие как генетические факторы у иранских и афганских детей и / или состав противотуберкулезных препаратов, доступных в Исламской Республике Иран, могут быть причиной высокой наблюдаемой устойчивости к рифампицину.Кроме того, Национальный научно-исследовательский институт туберкулеза и болезней легких является справочным центром, поэтому данные о высоком уровне устойчивости к рифампицину не могут быть экстраполированы на все общество.

Рекомендуется проводить более подробные культуральные исследования и антибиотикограммы у детей с ТБ, особенно у тех, у кого есть клинические и / или радиологические доказательства лекарственной устойчивости, и необходимы постоянные меры для контроля распространения лекарственной устойчивости в нашем обществе.

Список литературы

  1. Rieder HL. Лекарственно-устойчивый туберкулез: вопросы эпидемиологии и проблемы общественного здравоохранения. Туберкулез и болезнь легких, 1994, 75: 321–3.
  2. Шауле П., Булахбал Ф., Гроссет Дж. Эпиднадзор за лекарственной устойчивостью для борьбы с туберкулезом: почему и как? Туберкулез и болезнь легких, 1995, 76: 487–92.
  3. Swanson DS, Старк-младший. Лекарственно-устойчивый туберкулез в педиатрии. Педиатрические клиники Северной Америки, 1995, 42: 553–81.
  4. Cohn DL, Bustero F, Raviglione MC.Туберкулез с лекарственной устойчивостью: обзор ситуации в мире и Глобальный проект ВОЗ / IUATLD по эпиднадзору. Международный союз борьбы с туберкулезом и болезнями легких. Клинические инфекционные болезни, 1997, 24 (приложение 1): S121–30.
  5. Pablos-Mendez A et al. Глобальный эпиднадзор за устойчивостью к противотуберкулезным препаратам, 1994–1997 гг. Рабочая группа Всемирной организации здравоохранения и Международного союза борьбы с туберкулезом и легочными заболеваниями по надзору за лекарственной устойчивостью к туберкулезу. Медицинский журнал Новой Англии, 1998 г., 338: 1641–9.
  6. Триведи СС, Десаи С.Г. Первичная устойчивость к противотуберкулезным препаратам и приобретенная устойчивость к рифампицину в Гуджарате, Индия. Бугорок, 1988, 69: 37–42.
  7. Freiden TR et al. Возникновение лекарственно-устойчивого туберкулеза в Нью-Йорке. Медицинский журнал Новой Англии, 1993 г., 328: 521–6.
  8. Schaaf HS et al. Первичный лекарственно-устойчивый туберкулез у детей. Международный журнал туберкулеза и болезней легких, 2000, 4 (12): 1149–55.
  9. Zwolska Z, Augustynowicz-Kopec E, Klatt M.Первичная и приобретенная лекарственная устойчивость у больных туберкулезом в Польше: результаты исследования национальной программы надзора за лекарственной устойчивостью. Международный журнал туберкулеза и болезней легких, 2000, 4 (9): 832–6.
  10. Харрис А.Д., Махер Д. ТБ / ВИЧ: клиническое руководство. Женева, Всемирная организация здравоохранения, 1996: 61–8 (WHO / TB / 96.200).
  11. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам в мире. Глобальный проект ВОЗ / IUATLD по надзору за устойчивостью к противотуберкулезным препаратам, 1994–1997 гг.Женева, Всемирная организация здравоохранения, 1997 г. (WHO / TB / 97.229).
  12. Хейфец Л., Гуд Р. Современные лабораторные методы диагностики туберкулеза В: Блум Б.Р., изд. Туберкулез: патогенез, защита и борьба. Вашингтон, округ Колумбия, Американское общество микробиологии Press, 1994: 85–110.
  13. Kent PT, Kubica GP. Микобактериология общественного здравоохранения: руководство для лаборатории уровня III. Атланта, Джорджия, Центры по контролю за заболеваниями, 1995.
  14. Лабораторные услуги по борьбе с туберкулезом.Женева, Всемирная организация здравоохранения, 1999 г. (WHO / TB / 98.255).
  15. Glynn JR et al. Паттерны первичной и приобретенной устойчивости к противотуберкулезным препаратам в округе Каронго, Малави. Ланцет, 1995, 345: 907–10.
  16. Steiner P et al. Первичный лекарственно-устойчивый туберкулез у детей. Появление первичных штаммов M. tuberculosis с лекарственной устойчивостью к рифампицину. Американский обзор респираторных заболеваний, 1986, 134: 446–8.
  17. Steiner P et al. Продолжающееся исследование первичной лекарственной устойчивости туберкулеза среди детей, наблюдаемое в Медицинском центре больницы округа Кингс в период с 1961 по 1980 год.Американский обзор респираторных заболеваний, 1983, 128: 425–8.
  18. Schaaf HS et al. Первичный лекарственно-устойчивый туберкулез у детей. Международный журнал туберкулеза и болезней легких, 2000, 4: 1149–55.
  19. Nelson LJ et al. Эпидемиология детского туберкулеза в США, 1993–2001 годы: необходимость постоянного бдения. Педиатрия, 2004, 114: 333–41.
  20. Аль-Марри MR. Структура микобактериальной устойчивости к четырем противотуберкулезным препаратам у больных туберкулезом легких в государстве Катар после внедрения DOTS и ограниченной программы скрининга экспатриантов.Международный журнал туберкулеза и болезней легких, 2001, 5 (12): 1116–21.
  21. Weyer K et al. Лекарственная устойчивость туберкулеза в Западном Кейптауне. Южноафриканский медицинский журнал, 1995, 85: 499–505.
  22. Херли Дж. С., Эндрю Дж. Х. Бактериология и лекарственная восприимчивость туберкулеза в больнице Святого Винсента, Мельбурн, 1962–1991. Бугорок и болезнь легких, 1993, 74: 163–6.

Первичная устойчивость к блокаде иммунных контрольных точек в STK11 / TP53 / KRAS

Введение

Мутации KRAS являются наиболее распространенным онкогенным фактором немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), на который приходится 20–30% случаев аденокарциномы легких. 1 Они связаны с курением сигарет и связаны с плохим прогнозом без доступной целевой терапии. 2 Появление в последние годы ингибиторов иммунных контрольных точек (ICI) расширило возможности лечения НМРЛ; однако клинические данные об их эффективности при опухолях с мутантами KRAS противоречивы в разных клинических условиях. 3,4 Недавнее исследование продемонстрировало, что результаты лечения с помощью ICI были сходными между KRAS -мутантным и KRAS -диким типом НМРЛ, и ответ был лучше у пациентов с лигандом 1 (PD-L1) -позитивной запрограммированной смертью. в обеих популяциях. 5 Интересно, что данные свидетельствуют о том, что одновременные геномные изменения могут влиять на ответ и прогноз KRAS -мутантного НМРЛ. 6–9 Сопутствующие мутации в STK11 были связаны с уменьшением выживаемости у пациентов с мутантными опухолями KRAS после химиотерапии. 6–8 La Fleur et al. Оценили мутационный статус 82 генов с помощью целевого секвенирования у 352 пациентов с НМРЛ и продемонстрировали, что мутации STK11 и TP53 связаны с плохой выживаемостью пациентов у подтипов мутантов KRAS . 9 Эти исследования предполагают, что не сами мутации KRAS , а совместные мутации в других генах определяют агрессивное поведение опухолей и результаты лечения у пациентов с ведущей мутацией.

Предыдущие исследования показали, что мутации STK11 и TP53 редко перекрываются у пациентов с НМРЛ, не получавших лечения, 7,10 и влияние этих сложных мутаций на эффективность иммунотерапии для KRAS -мутантного НМРЛ остается невыясненным. выяснил.Здесь мы сообщаем о случае аденокарциномы легких, несущей тройную мутацию STK11 / TP53 / KRAS , которая показала плохой ответ на монотерапию пембролизумабом первой линии, даже несмотря на то, что опухоль сильно экспрессировала PD-L1.

Презентация кейса

70-летний мужчина обратился в наше учреждение в сентябре 2019 года с жалобой на непрекращающийся кашель, который длился три месяца. Он никогда не курил и несколько лет принимал статины и гипотензивные препараты. Его жизненные показатели были стабильными, и физикальное обследование не выявило существенных результатов.Компьютерная томография (КТ) грудной клетки и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) выявили злокачественную массу легкого размером 4,8 x 4,3 см в левой нижней доле (LLL), проникающую в соответствующий бронх, а также множественные лимфатические узлы средостения и метастазы в кости, что позволяет предположить, что рак находился на стадии IV (рис. 1A и B). Бронхоскопия показала нерегулярные изменения слизистой оболочки и выступающую массу в устье LLL, а гистопатология выявила инвазивную муцинозную аденокарциному легких, положительную по фактору транскрипции щитовидной железы 1 (TTF-1).Хотя рутинное профилирование мутаций исключило несколько генетических изменений, включая мутации рецептора эпидермального фактора роста и слияния киназы анапластической лимфомы ( ALK ) или протоонкогена 1 ROS ( ROS1 ), оценивалась оценка доли опухолей PD-L1 (TPS) с использованием анализа 22C3 PharmDx составила 100%. Мы начали монотерапию пембролизумабом первой линии (200 мг внутривенно каждые три недели) в качестве терапии первой линии, ожидая положительного ответа. Первая оценка ответа, проведенная в ноябре 2019 года, показала небольшое увеличение размера первичной опухолевой массы и лимфатических узлов средостения (рис. 1C).Принимая во внимание возможность псевдопрогрессии, мы продолжили еще два цикла лечения, которые хорошо переносились пациентами без возникновения побочных эффектов, связанных с иммунитетом. Однако кашель пациента было трудно контролировать, несмотря на использование противокашлевых средств, ингаляционных бронходилататоров и системных кортикостероидов. Последующее наблюдение за пациентами с помощью компьютерной томографии грудной клетки и ПЭТ, проведенных в январе 2020 года, показало заметное увеличение как первичной опухоли легкого, так и лимфатических узлов средостения, а также несколько недавно развившихся метастазов в кости (рис. 1D и E).Уровень карциноэмбрионального антигена также повысился до 57,2 нг / мл по сравнению с исходным уровнем 21,9 нг / мл. Мы немедленно прекратили первичное лечение и перешли на цитотоксическую химиотерапию (пеметрексед и карбоплатин). В то же время мы выполнили секвенирование следующего поколения (NGS), чтобы изолировать генетические изменения, которые могут быть связаны с плохой реакцией на пембролизумаб у нашего пациента. NGS выявил три параллельные мутации в генах KRAS (p.G12V), TP53 (p.E286K) и STK11 (p.Y36fs *) (рисунок 1F). Вскоре после первого курса химиотерапии у пациента развилась пневмония. Уровни С-реактивного белка и прокальцитонина в сыворотке повысились до 12,7 мг / дл (норма: <0,5 мг / дл) и 1,27 нг / мл (норма: <0,046 нг / мл) соответственно. Кроме того, компьютерная томография грудной клетки показала определенную бронхиальную обструкцию при LLL, в то время как в правом легком не было обнаружено помутнений матового стекла или уплотнения воздушного пространства. Это указывает на связь пневмонии с бронхиальной обструкцией, а не с иммунотерапией и последующей химиотерапией.Несмотря на интенсивную терапию с применением антибиотиков широкого спектра действия и ИВЛ, пневмония быстро переросла в сепсис, от которого пациент скончался в феврале 2020 года.

Рис. 1 Сканирование грудной клетки с помощью компьютерной томографии (КТ) и позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) во время лечения пембролизумабом. ( A ) Первоначальная компьютерная томография грудной клетки показала консолидированное образование (звездочка) и небольшое эндобронхиальное образование в левой нижней доле (LLL, стрелка), которое позже было идентифицировано как инвазивная муцинозная аденокарцинома.( B ) Исходное ПЭТ-сканирование показало гиперметаболические поражения в LLL легкого, средостенных лимфатических узлах, шипах и ребрах. ( C ) КТ грудной клетки после трех циклов монотерапии пембролизумабом показала небольшое увеличение как массы LLL, так и эндобронхиального поражения. ( D и E ) Последующие КТ и ПЭТ-сканирование грудной клетки после пяти циклов лечения показали заметное увеличение массы LLL, обострение ранее идентифицированных метастатических поражений и несколько новых метастазов в позвоночник.( F ) Секвенирование следующего поколения показало, что опухоль содержала мутаций соединения STK11 / TP53 / KRAS .

Обсуждение

Иммунотерапия рака с помощью ICI показала многообещающие результаты в многочисленных клинических испытаниях и стала одним из наиболее важных достижений в лечении солидных опухолей, включая рак легких. 11 Антитела против PD-1 и PD-L1 стали стандартом лечения второй линии для всех пациентов с НМРЛ и первой линии для пациентов с высокой экспрессией PD-L1.Было последовательно показано, что экспрессия PD-L1 коррелирует с повышенной эффективностью лечения анти-PD-1 / PD-L1. 12–14 Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США одобрило использование клонов анти-PD-L1, 22C3 и 28–8, в качестве сопутствующего диагностического метода для пембролизумаба и дополнительного диагностического метода для ниволумаба, соответственно, в 2015 г. Однако Одной экспрессии PD-L1 недостаточно для прогнозирования реакции пациента на ICI. 15 Мутационная нагрузка опухоли (TMB) и сопутствующие генетические изменения появились как новые прогностические биомаркеры для иммунотерапии с блокадой иммунных контрольных точек. 16

STK 11 (также известный как киназа печени B1, LKB1 ) представляет собой ген-супрессор опухоли, кодирующий серин / треонинкиназу 11, которая непосредственно фосфорилирует AMP-активированную протеинкиназу (AMPK), регулируя метаболизм липидов, холестерина и глюкозы в организме человека. разнообразные ткани. 8 Передача сигналов SKT11-AMPK негативно регулирует у млекопитающих путь рапамицина, который обычно не регулируется при злокачественных новообразованиях человека. 17,18 Соматические мутации в SKT11 , которые в первую очередь вызывают потерю функции, присутствуют примерно у 30% пациентов с НМРЛ с повышенной распространенностью, наблюдаемой у курильщиков и пациентов с мутациями KRAS . 19,20 Мутации STK11 сами по себе, по-видимому, не предсказывают ответ на химиотерапию; однако появление ко-мутаций STK11 / KRAS было связано с уменьшением выживаемости у пациентов с НМРЛ при различных условиях лечения. 6–8 TP53 представляет собой ДНК-связывающий фактор транскрипции, который регулирует репарацию ДНК, метаболизм и апоптоз. 21 TP53 Только мутации были связаны с плохим ответом и выживаемостью у пациентов с НМРЛ, получавших химиотерапию или хирургическую резекцию, 22,23 , в то время как их прогностическое значение для KRAS -мутантных опухолей остается неубедительным. 6,7,9

Текущие данные свидетельствуют о том, что мутации в STK11 и TP53 оказывают противоположное влияние на клинические исходы иммунотерапии. 4,7 Мутации STK11 вызывают истощение Т-лимфоцитов и секрецию иммуносупрессивных цитокинов, что приводит к образованию невоспалительного микроокружения опухоли (TME) со слабой экспрессией PD-L1, и были связаны с неблагоприятными клиническими исходами у пациентов с НМРЛ, получавших иммунную контрольную точку. блокадная терапия. 4,7,24 Напротив, опухоли, несущие мутации TP53 , характеризуются частыми соматическими мутациями, воспаленным TME и благоприятным ответом на ингибирование PD-1 / PD-L1. 4,7 Тройные мутации STK11 / TP53 / KRAS исключительно редки; только семь из 1385 пациентов с НМРЛ имели эту мутацию. 10 Таким образом, клиническое значение этих сложных мутаций в иммунотерапии никогда не обсуждалось. В нашем случае была продемонстрирована устойчивость de novo к монотерапии пембролизумабом первой линии, несмотря на сильную экспрессию PD-L1. Насколько нам известно, это первый случай, описывающий неблагоприятный клинический исход после блокады иммунных контрольных точек для NSCLC, несущего ко-мутаций KRAS / STK11 / TP53 .Недавнее исследование Bange et al. Продемонстрировало, что тройная мутация STK11 / TP53 / KRAS при распространенном НМРЛ дает лучший прогноз после терапии первой линии по сравнению с ко-мутациями STK11 / KRAS или только SKT11 . 10 Среди шестидесяти двух пациентов, включенных в это исследование, пятьдесят один (82%) получал химиотерапию с платиновым дублетом, в то время как только пять пациентов (8%) получали иммунотерапию в качестве лечения первой линии. 10 Таким образом, влияние ко-мутаций STK11 / TP53 / KRAS на выживаемость оценивали в основном у пациентов, получавших химиотерапию.Кроме того, в это исследование были включены только семь пациентов с ко-мутациями STK11 / TP53 / KRAS . Эти предыдущие и наши результаты предполагают, что влияние сложных мутаций на выживаемость может быть различным в зависимости от настроек лечения. Механизм, лежащий в основе первичной устойчивости мутантной аденокарциномы легкого STK11 / TP53 / KRAS-, к блокаде иммунных контрольных точек в нашем случае остается неясным; однако это может быть частично объяснено сильным пролиферативным стимулом и сильным иммунным бегством, опосредованным мутациями в каждом из этих генов, как описано в предыдущих исследованиях. 6,7 Интересно, что предыдущие исследования продемонстрировали, что TP53 имеет четыре потенциальных сайта связывания в промоторной области STK11 , предполагая, что он может действовать как регулятор STK11 . 25,26 Таким образом, возможно, что мутации в TP53 модулируют передачу сигналов STK11 , что может усиливать нераспространенный фенотип TME. Эта гипотеза должна быть подтверждена будущими исследованиями.

Таким образом, мы описали случай редкой STK11 / TP53 / KRAS -мутантной аденокарциномы легкого, которая продемонстрировала устойчивость к терапии анти-PD-1.Хотя необходимо собрать дополнительные доказательства, в нашем отчете предполагается, что эта мутация соединения может быть сильным прогностическим биомаркером неблагоприятных исходов лечения при ВКИ и может представлять собой отдельный агрессивный подтип, требующий уникальных терапевтических стратегий, отличных от иммунотерапии, даже если опухоль сильно экспрессирует PD- L1. Кроме того, наш случай подчеркивает важность всестороннего молекулярного профилирования в рутинной клинической практике, даже в этих условиях лечения, и поддерживает разработку клинических испытаний для облегчения «персонализированной иммунотерапии» для генетически определенных подмножеств НМРЛ.

Согласие на публикацию

Письменное информированное согласие было получено от жены пациента на публикацию истории болезни и сопровождающих его изображений.

Заявление об обмене данными

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, доступны в этой рукописи.

Заявление об этике

Публикация этого отчета была одобрена Экспертным советом больницы Университета Кён Хи (KHUH 2020-06-010).

Благодарности

Авторы благодарят пациента и его семью за разрешение опубликовать этот отчет вместе с прилагаемыми изображениями.

Исследовательский фонд, финансируемый Министерством науки Это исследование было поддержано грантом Программы фундаментальных исследований Национального исследовательского фонда, финансируемого Министерством науки и ИКТ (2019R1F1A1041812) Республики Корея.

Раскрытие информации

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

Список литературы

1. Ли Ш. Химиотерапия рака легких в эпоху персонализированной медицины. Tuberc Respir Dis (Сеул) . 2019; 82 (3): 179–189. DOI: 10.4046 / trd.2018.0068

2. Атлас генома рака. Исследование N. Комплексное молекулярное профилирование аденокарциномы легких. Природа . 2014; 511 (7511): 543–550.

3. Боргей Х., Пас-Арес Л., Хорн Л. и др. Ниволумаб в сравнении с доцетакселом при запущенном не плоскоклеточном немелкоклеточном раке легкого. N Engl J Med .2015. 373 (17): 1627–1639. DOI: 10.1056 / NEJMoa1507643

4. Скулидис Ф., Голдберг М.Э., Гринуолт Д.М. и др. Мутации STK11 / LKB1 и резистентность к ингибитору PD-1 в аденокарциноме легких с мутантным KRAS. Рак Дисков . 2018; 8 (7): 822–835. DOI: 10.1158 / 2159-8290.CD-18-0099

5. Джинсон А., Томазини П., Соке-Брессанд М. и др. Эффективность ингибиторов иммунных контрольных точек при немелкоклеточном раке легких (NSCLC) с мутантным KRAS. J Thorac Oncol . 2019; 14 (6): 1095–1101. DOI: 10.1016 / j.jtho.2019.01.011

6. Arbor KC, Jordan E, Kim HR, et al. Влияние сопутствующих геномных изменений на исходы у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, мутантным по KRAS. Clin Cancer Res . 2018; 24 (2): 334–340. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-17-1841

7. Скулидис Ф., Байерс Л.А., Диао Л. и др. Сопутствующие геномные изменения определяют основные подмножества KRAS-мутантной аденокарциномы легких с отличной биологией, иммунными профилями и терапевтической уязвимостью. Рак Дисков .2015; 5 (8): 860–877. DOI: 10.1158 / 2159-8290.CD-14-1236

8. Шабат М.Б., Валлийский Е.А., Фулп В.Дж. и др. Дифференциальная ассоциация STK11 и TP53 с экспрессией, пролиферацией и иммунным надзором генов, связанных с мутацией KRAS, при аденокарциноме легкого. Онкоген . 2016; 35 (24): 3209–3216. DOI: 10.1038 / onc.2015.375

9. Ла Флер Л., Фальк-Сорквист Э., Смедс П. и др. Паттерны мутаций в популяционной когорте немелкоклеточного рака легкого и прогностическое влияние сопутствующих мутаций в KRAS и TP53 или STK11. Рак легких . 2019; 130: 50–58. DOI: 10.1016 / j.lungcan.2019.01.003

10. Банге Э., Мармарелис М.Э., Хванг В.Т. и др. Влияние ко-мутаций KRAS и TP53 на исходы после системной терапии первой линии у пациентов с распространенным немелкоклеточным раком легкого с мутацией STK11. JCO Precis Oncol . 2019; 3: 1–11.

11. Dall’Olio FG, Maggio I, Massucci M, Mollica V, Fragomeno B, Ardizzoni A. Статус работы ECOG> / = 2 в качестве прогностического фактора у пациентов с распространенным немелкоклеточным раком легкого, получавших лечение ингибиторами иммунных контрольных точек-A систематический обзор и метаанализ реальных данных. Рак легких . 2020; 145: 95–104.

12. Хербст Р.С., Баас П., Ким Д.В. и др. Пембролизумаб в сравнении с доцетакселом при ранее леченных, PD-L1-положительных, распространенных стадиях немелкоклеточного рака легкого (KEYNOTE-010): рандомизированное контролируемое исследование. Ланцет . 2016; 387 (10027): 1540–1550. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (15) 01281-7

13. Рек М., Родригес-Абреу Д., Робинсон А.Г. и др. Обновленный анализ KEYNOTE-024: пембролизумаб в сравнении с химиотерапией на основе платины для запущенного немелкоклеточного рака легкого с долей опухоли PD-L1 50% или выше. Дж. Клин Онкол . 2019; 37 (7): 537–546. DOI: 10.1200 / JCO.18.00149

14. Rizvi NA, Mazieres J, Planchard D, et al. Активность и безопасность ниволумаба, ингибитора иммунных контрольных точек против PD-1, для пациентов с запущенным, рефрактерным плоскоклеточным немелкоклеточным раком легкого (CheckMate 063): фаза 2, исследование в одной группе. Ланцет Онкол . 2015; 16 (3): 257–265. DOI: 10.1016 / S1470-2045 (15) 70054-9

15. Ким Т., Ча Ю.Дж., Чанг Ю.С. Корреляция экспрессии PD-L1, тестируемой 22C3 и SP263 при немелкоклеточном раке легкого, и ее прогностический эффект на аденокарциному легкого с положительной мутацией EGFR. Tuberc Respir Dis (Сеул) . 2020; 83 (1): 51–60. DOI: 10.4046 / trd.2019.0026

16. Kim HC, Choi CM. Текущее состояние иммунотерапии рака легких и перспективы на будущее. Tuberc Respir Dis (Сеул) . 2020; 83 (1): 14–19. DOI: 10.4046 / trd.2019.0039

17. Wullschleger S, Loewith R, Hall MN. Передача сигналов TOR в росте и метаболизме. Ячейка . 2006. 124 (3): 471–484. DOI: 10.1016 / j.cell.2006.01.016

18. Shackelford DB, Shaw RJ. Путь LKB1-AMPK: метаболизм и контроль роста при подавлении опухоли. Нат Рев Рак . 2009. 9 (8): 563–575. DOI: 10.1038 / nrc2676

19. Мацумото С., Ивакава Р., Такахаши К. и др. Распространенность и специфичность генетических изменений LKB1 при раке легких. Онкоген . 2007. 26 (40): 5911–5918. DOI: 10.1038 / sj.onc.1210418

20. Факкинетти Ф., Блутген М.В., Тергемина-Клен Г. и др. Мутации LKB1 / STK11 у пациентов с немелкоклеточным раком легкого: описательный анализ и прогностическая ценность. Рак легких . 2017; 112: 62–68. DOI: 10.1016 / j.lungcan.2017.08.002

21. Оливье М., Холлштейн М., Эно П. Мутации TP53 при раке человека: происхождение, последствия и клиническое использование. Колд Спринг Харб Перспект Биол . 2010; 2 (1): а001008. DOI: 10.1101 / cshperspect.a001008

22. Мицудоми Т., Хамадзима Н., Огава М., Такахаши Т. Прогностическое значение изменений p53 у пациентов с немелкоклеточным раком легкого: метаанализ. Clin Cancer Res . 2000. 6 (10): 4055–4063.

23. Кандиолер Д., Стаматис Г., Эберхардт В. и др.Растут клинические доказательства взаимодействия генотипа p53 и ответа на индукционную химиотерапию при запущенном немелкоклеточном раке легкого. J Thorac Cardiovasc Surg . 2008. 135 (5): 1036–1041. DOI: 10.1016 / j.jtcvs.2007.10.072

24. Koyama S, Akbay EA, Li YY, et al. Дефицит STK11 / LKB1 способствует привлечению нейтрофилов и продукции провоспалительных цитокинов для подавления активности Т-клеток в микроокружении опухоли легких. Cancer Res . 2016; 76 (5): 999–1008. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-15-1439

25. Ризви Н.А., Хеллманн М.Д., Снайдер А. и др. Иммунология рака. Мутационный ландшафт определяет чувствительность к блокаде PD-1 при немелкоклеточном раке легкого. Наука . 2015; 348 (6230): 124–128. DOI: 10.1126 / science.aaa1348

26. Ван Аллен Е.М., Мяо Д., Шиллинг Б. и др. Геномные корреляты ответа на блокаду CTLA-4 при метастатической меланоме. Наука . 2015; 350 (6257): 207–211. DOI: 10.1126 / science.aad0095

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.